高效液相色谱法(14).ppt

第二章高效液相色谱法
一、高效液相色谱法
的特点
二、流程及主要部件
三、影响分离的因素
四、高效液相色谱法
的主要分离类型
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液相色谱仪（1）
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液优点，具有高柱效、高选择性、分析速度快、灵敏度高、重复性好、应用范围广等优点。
目前高效液相色谱法已被广泛应用于分析对生物学和医药上有重大意义的大分子物质，例如蛋白质、核酸、氨基酸、多糖类、植物色素、高聚物、染料及药物等物质的分离和分析。
高效液相色谱法的仪器设备费用昂贵，操作严格，这是它的主要缺点。
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二、流程及主要部件

高压输液系统 —— 进样系统 —— 分离系统—— 检测系统 —— 数据处理系统
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Agilent 1100 LC的主要部件
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(1) 高压输液系统
主要部件之一，包括贮液装置、高压输液泵、过滤器、脱气装置等
高压输液泵压力：150～350×105 Pa。
为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。
基本要求：
应具有压力平稳、脉冲小、流量稳
定可调、耐腐蚀等特性
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(2) 梯度淋洗装置
外梯度:
利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。
内梯度:
一台高压泵, 通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。
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(3) 进样装置
流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，也可配备自动进样装置。
其结构如图所示：
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(4) 高效分离系统
色谱分离系统包括色谱柱、固定相和流动相。色谱柱是其核心部分，柱体为直型不锈钢管，内径1～6 mm，柱长5～40 cm。
发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。
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(5) 高效液相色谱检测器
紫外光度检测器（UVD）：最小检测量10-9g·mL-1，对流量和温度的波动不敏感，可用于梯度洗脱。
最常用的检测器。
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光电二极管阵列检测器
光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。
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（6） 数据处理系统
色谱工作站的功能：
色谱参数的选择和设定；
自动化操作仪器；
色谱数据的采集和存储，并作“实时”处理；
对采集和存储的数据进行后处理；
自动打印，给出一套完整的色谱分析数据和图谱。
同时也可把一些常用色谱参数、操作程序，及各种定量计算方法存入存储器中，需用时调出直接使用。
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1. 固定相及分离柱
气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其选用原则与气相色谱一样。
选择合适的固定相，降低填料粒度可显著提高柱效，但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常高的工作，一般很少自行制备。
选择短柱、细内径提高分析速度；
研制高效柱填料是一活跃领域。
三、影响分离的因素
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2. 流动相及流动相的极性
（1）可显著改变组分分离状况的流动相选择在液相色谱中显得特别重要。 液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。
（2）亲水性固定液常采用疏水性淋洗液，即淋洗液的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。
（3）若淋洗液的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。
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流动相组成
流动相按组成不同可分为单组分和多组分；
按极性可分为极性、弱极性、非极性；
按使用方式有固定组成淋洗和梯度淋洗。
常用溶剂:
己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。
采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。
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选择流动相时应注意的几个问题：
（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。
（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。
（3）试样在流动相中应有适宜的