新型转基因减毒疟疾疫苗的构建与抗疟疾机理研究.pdf

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/嬲燃螋√弩新签名::旦圭生;旦鷌旦三生蕉查。本人郑重声明:所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下,独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外,本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品或成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。论文作者签名:本人完全了解海南大学关于收集、保存、使用学位论文的规定,即:学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和借阅。本人授权海南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本人在导师指导下完成的论文成果,知识产权归属海南大学。保密论文在解密后遵守此规定。本人已经认真阅读“咝Q宦畚娜氖菘夥⒉颊鲁獭保饨ū救说难宦畚提交“高校学位论文全文数据库”中全文发布,并可按“章程”中规定享受相关权益。日期:年日期:年导师签名:日期:年
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∥。Ⅳ㈠卜㈠发澧宀罚摘要疟疾是一种古老的寄生虫传染病,严重威胁着人类健康,阻碍着社会发展。据钚鹿ú。经过若干增殖周期后致使红细胞破裂,出现临床症状。由亿人感染疟原虫,。近年来,虽然在疟疾控制方面取得了显著的成绩,但由于疟原虫抗药性以及蚊媒对杀虫剂抗性的产生和扩散,使疟疾防治面临严重困难。当前普遍认为,研制安全、价廉和有效的疫苗是人类控制乃至根除疟疾的重要途径。世界卫生组织、联合国计划开发署、世界银行等已将疟疾疫苗研究项目作为全球优先发展的三大疫苗项目之一。疟疾感染从雌性按蚊叮咬人体,其唾液腺中的成熟疟原虫子孢子随蚊虫的唾液注入宿主血液循环开始,随后子孢子进入肝细胞,在其中行裂体增殖而形成裂殖体。成熟后肝细胞破裂,裂殖子被释放入血液,进入红细胞并在此可见,子孢子是疟疾感染人类宿主的上游环节,以子孢子作为疟疾疫苗引起有效的免疫应答可阻断子孢子进入肝细胞从而终止疟疾生活史,达到有效防治疟疾的目的。疟疾疫苗的开发研究已有多年的历史,经历了全虫疫苗ㄋ酪呙和放射减毒活疫苗⒒蚬こ萄堑ノ灰呙绾突Ш铣傻亩嚯囊呙纭⒑怂峒安原载体疫苗等几个时期。但是,所有这些疫苗在人体试验中都没有达到理想的效果,其中疫苗的安全性、诱导的免疫应答特异性和效价不高、免疫力持续时间短等都是其中原因之一。如何兼顾疫苗的安全性及增高疟疾疫苗的免疫反应能力,延长疫苗免疫反应的时间是疟疾研究疫苗研究的重要内容。热擞没蚯贸姆椒ń痹鎁蚯贸螅⑾秩笔Я基因的子孢子具有减毒功能,感染动物模型后疟原虫子孢子停留于肝细胞期而不发展为红细胞期疟疾而终止疟疾生活史,将其作为减毒全虫疫苗,在小鼠疟疾模型中可以诱导产生十分理想的免疫保护作用。本研究利用基因打靶技术敲除伯氏疟原虫的基因,同时为了获得良好的免疫效果,利用转基因技术将具有免疫增强作用的馨拖赴骰蜃
珺=蚬こ碳醵镜牟吓痹鎁蚯贸柿V再转染疟原虫子孢子,以期获得一种既有减毒,又能够增加免疫功能的新型疟原虫株疊。墙晷路⑾值囊恢痔匾煨郧骰疊细胞的细胞因子,并能刺激细胞表达趋化因子受体,参与引导赴挠巫吆凸槌玻芪鼴细胞和胞趋化到免疫应答部位从而增强特异免疫应答。将阠基因修饰疟疾疫苗,则可增强针对疟原虫的特异性体液免疫应答及细胞免疫应答。本研究根据基因库提供的小鼠蛐蛄猩杓瓶寺±┰鯞的基因序列的引物,∈驜基因,通过限制性内切酶酶切和酶连接,;蛑刈橹柿!V刈橹柿:邢⑴倍ǹ剐曰蚝吐躺光蛋白的报告基因,可在转化子中表达。筛选重组质粒并经酶切和蛄胁定证实正确性后,体外转染真核细胞。经琼脂糖凝胶电泳发现扩增的小鼠基因序列分子量大小和预期值相一致,重组质粒酶切结果和预期值相符,蛄胁舛ㄏ允局刈橹柿5哪康幕蛟亩量蚣茏既肺尬蟆4觤鞍字时达二个层面证明重组质粒可以在真核细胞中有效表达阠基因。证明已成功构建了伯氏疟原虫;蛑刈橹柿‘/伯氏疟原虫在转化前经体外短期培养,利用密度梯度介质分离子孢子用于电穿孔转化。将构建的伯氏疟原虫;蛑刈橹柿>盖邢咝化后转染伯氏疟原虫,获得’/疟原虫株。将此疟原虫株经尾静脉注入小鼠体内,用息疟定腹腔内注射进行药物筛选,经稚秆『螅玫搅搜粜缘伯氏疟原虫转化子。在荧光显微镜下观察到经息疟定筛选的原虫呈现绿色荧光:经觳獾搅酥刈橹柿5拇嬖冢得髦刈橹柿R颜返恼显诓吓痹虫基因之中。本研究进一步在小鼠伯氏疟疾模型中,采用分子生物学、免疫学和组织学等技术对获得的。/疟原虫株进行抗疟机理研究。结果发现‘/疟原虫株可以在肝细胞期有效生长,但未能有效发