调控胃癌BGC823细胞PTEN和Livin基因表达的生物学效应实验研究.pdf

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中文摘要调控胃癌细胞和虮泶锏生物学效应实验研究博士研究生赵春临郑州大学第一附属医院外科背景与目的导师王家祥胃癌的发病率在恶性肿瘤中位居第四位,仅次于肺癌、乳腺癌和肠癌,是严重威胁我国人民生命健康的主要疾病之一,其发病机制迄今为止仍不明确。胃癌在发病早期症状不典型,部分患者就诊时已进入进展期。尽管在手术、化疗、放疗等方面取得了长足进步,但是进展期胃癌患者术后晟媛嗜晕廾飨提高。大量研究表明,胃癌在发生、发展过程中有多种因素的参与,包括抑癌基因失活、癌基因突变、鹕诵薷垂δ艿慕档汀⑿藕抛5纪泛偷蛲龉痰囊常等,提示胃癌的发生、发展是一个多因素、多阶段、多步骤的过程。第号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源基因蔷哂兴匾煨粤姿崦富钚缘囊职基因,可以负调节信号通路的信号转导,具有抑制细胞增殖和迁移以及促进凋亡的效应。基因的突变、缺失以及甲基化可以导致其抑癌功能丧失,引起肿瘤的发生。研究显示,胃癌组织中基因表达显著降低,并且蛋白表达水平与肿瘤大小、分型、淋巴结转移和肿瘤分期呈负相关,表明基因失活可能是胃癌发生、发展的原因之一。堑蛲鲆种频癧刍,家族新成员之一,它可以和半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶苯咏岷隙种葡赴蛲觯进而起到促进肿瘤细胞生长的作用。研究发现鞍自诎ㄎ赴┰谀诘亩嘀
第一部分基因表达载体、騭载体的构建和鉴定方法壮申肿瘤组织中呈现高表达,沉默肿瘤细胞中蚩梢源俳赴蛲觥⒁种浦瘤增殖。表明母弑泶镉胫琢龅姆⑸⒎⒄辜霸ず笙喙亍本课题采用分子生物学技术,分别建立过表达基因、沉默表达以及过表达同时沉默虮泶锏奈赴┫赴辏煌ü谔搴屠胩实验,观察调控和虮泶锒晕赴┫赴ぁ⒃鲋场⒌蛲龊颓ㄒ频方面的影响,为胃癌的治疗提供新的靶点和策略。课题共分三部分:第一部分,基因表达载体、騭载体的构建和鉴定;第二部分,体外调控、虮泶锒晕赴〣赴镅形5挠跋欤坏谌糠郑调控/基因表达对裸鼠移植瘤生长的影响。设计带有蚐盖形坏愕腜蛉ū嗦肭鴆┰鲆铮┰:扩增产物经蚐盖泻笥氡达载体甶刈椋挥肊和双酶切鉴定转化重组子,,合成发卡样チ矗煌嘶鸪伤春笥靥錺..刈椋挥肞扩增筛选转化重组子,蛄胁舛ḿ定插入序列,得到稣攵訪基因的靥濉7直鹩弥侍H綛赴珿秆〉玫蕉杂Φ奈榷ㄗH鞠胞。采用荧光定量和瓸直鸺觳庾H镜腂赴鸏和蛋白表达水平。甈扩增得到的文康幕颍蛔;蟮玫蕉喔重组子,经疭盖泻虳测序鉴定证实获得的重组子扫描人编码序列醪缴秆〉玫龊钛∑危瑽同源性分析,选择确定黾罨膕靶序列,分别为位丸气.、和甈贰和甊中文摘要二口;叶‘
达水平均显著降低,〣赴物学行为的影响方法捶⒖ㄑ鵇和雙重组后,都得到多个重组子,┰錾秆〖ê虳测序分析证实得到的阳性重组子甎...畇、甎。肷杓仆耆恢隆泶颬转染畁.⒊聊琇转染甎.、沉默转染甎.、沉默转染甎.、空载体转染和空载体H緋..细胞经筛选,均得到稳定转染细胞株。肟瞻锥哉障啾龋赵靥组和空载体榈腖和蛋白表达水平无明显变化,差异无显著性;与龆哉兆楸冉希泶颬椤沉默椤⒊聊琇楹统聊琇橄赴鸏和蛋白表榈南喽员达量最低。泶颬橄赴腜和蛋白表达水平显著高于其它各组切下沉默Ч罴裺载体中的ピ#刈槿隤基因表达载体畆甈玫奖泶颬颉⑼背聊琇基因的调控载体..肔包裹,然后将其转染细胞,筛选得到过表达同时沉默虻奈榷ㄗH鞠赴与第一部分获得的单一过表达的胃癌细胞株、单一沉默达的胃癌细胞株一起作为实验对象,采用和测定各组细胞蚉和蛋白表达水平、椒ḿ觳庀赴鲋场⒘式细胞法检测细胞周期和细胞凋亡、、
组细胞的和钚韵灾撸钜煊邢灾氏,,得到鎏醮和な礚单元成功插入;蛄胁舛ㄈ啡系玫窖粜灾刈樽印璆秆〉玫轿榷ㄗH緋—.奈赴〣