11重组蛋白纯化——可溶性蛋白纯化.docx

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样品制备
与“SOPNi-NTA层析柱亲和纯化6His标签融合蛋白”中样品制备方法相同,裂解缓冲液(50mMTris,150mM
NaCl,2mMEDTA,%NP-40,%TritonX-100,,1mMPMSF,1mMNaF,proteaseinhibitorscocktail,)。
(PMSF,DTT,proteaseinhibitorscocktail在破菌前加入。)
适合于GSTPull-Down的细菌裂解液配方还有很多
样品纯化
GlutathioneBeads亲和树脂灌装层析柱或直接使用GlutathioneBeads预装柱,层析柱下端接核酸蛋白检测
仪。
,纯化过程可在室温或4°C进行。
,让其流尽树脂保护液,快流干的时候用至少5倍体积的平衡/洗涤缓冲液(50mMTris,150mMNaCI,)冲洗柱子。
:1混合,加到平衡好的GlutathioneBeads中(保证目的蛋白与GlutathioneBeads充分接触,提高目的蛋白的回收率),收集流穿液。
〜15倍柱床体积的平衡/洗涤缓冲液清洗柱床,去除非特异性吸附的杂蛋白,收集洗涤液。
〜10倍柱床体积的洗脱缓冲液(50mMTris,150mMNaCl,10mM还原型谷胱甘肽,),收集洗脱液,即目的蛋白组分。丕原型Glutathione易氧化,也容易影响pH,需现用现配,。-PAGE检测分析纯化过程各组分
纯化过程中得到的样品(包括上样前样品液、流穿液、洗杂液和顺次收集的洗脱蛋白)以及原始样品使用SDS-PAGE检测分析纯化效果。
填料再生与保存
依次使用3倍柱床体积的平衡/洗涤缓冲液和5倍柱床体积的ddH2O平衡柱床,最后再用5倍柱床体积的20%的乙醇平衡,然后保存在等体积的20%的乙醇中,置于4C保存。
填料清洗
GST标签蛋白纯化产品可以重复使用而无需再生,但随着非特异性结合的蛋白的增多和蛋白的聚集,往往造成流速和结合载量都下降,这时需要对树脂进行清洗。
去除一些沉淀或变性物质
用2倍柱床体积的6M盐酸胍溶液进行清洗,然后立即用5倍柱床体积的PBS()清洗。
去除一些疏水性吸附造成的非特异性吸附物质
用3〜4倍柱床体积的70%乙醇或2倍柱床体积的1%TritonX-100清洗,然后立即用5倍柱床体积的PBS,。

HUH
柱子反压过高
填料被堵塞
按照“"部分进行树脂清洗。
裂解缓冲液中含有微小的固体颗粒,建议上柱前使用滤膜(”m)过滤,或者离心去除。
样品太粘稠
样品中含有高浓度的核酸,加长破碎时间直至粘度降低,或者添加DNaseI(终浓度5|ig/ml),Mg2+(终浓度为1mM),冰上孵育10〜15min。
缓冲液太粘稠
有机溶剂或者蛋白稳定试剂(如甘油等)可能会引起反压增高,降低操作流速。
洗脱组分中没有目的蛋白
GST标签蛋白变性了
使用温和的裂解条件,进行多种条件摸索。
过度的裂解使目的蛋白变性
目的蛋白聚集产生了沉淀
在细胞裂解前溶液中加入DTT,终浓度为1〜20mM。
细菌裂解不充分,蛋白没
有释放出来
优化裂解条件。
表达蛋白包涵体过多
优化诱导表达条件使其尽可能在上清表达。
融合蛋白改变了GST的构象,影响了目的蛋白的结
合力
如果空载体中GST有很高的亲和力,有可能改变融合蛋白的构象从而降低了GST标签蛋白的亲和力。裂解液中加5mMDTT可以改善结合效果。
降低结合温度至4°C,充分地清洗。
柱子平衡时间太短,目的
〜pH8范
围内结合的
〜(PBS)。
目的蛋白没有完全洗脱下来
洗脱体积太少
增加洗脱液体积,减小洗脱流速。
洗脱液中谷胱甘肽浓度太低
增加洗脱液中谷胱甘肽浓度,可尝试用50mMTris-HCl,20-。
低pH影响洗脱
在不增加洗脱液中的谷胱甘肽量时,提高洗脱液中pH至pH8〜9会有改善。
增加洗脱液中离子强度,〜。
洗脱液中的谷胱甘肽被氧
化
使用新鲜配制的洗脱液
加入DTT。
非特异性疏水作用影响目的蛋白的溶解与洗脱
洗脱液中加入非离子型洗涤剂,%的TritonX-100或者2%正辛基-0-D-毗喃葡糖苷Tween-20。
电泳或
westernbiot检测中发现多条带
分子量70kD蛋白与目的蛋白一起被纯化出来
分子量70kD的蛋白有可能是大肠杆菌基因DnaK的产物,可以通过在目的蛋白中加入(50mMTris-HCI,2mMATP,)在37°C加热10min去除。
可以通过ATP-琼脂糖胶或离子交换来去除目的蛋白溶液中的DnaK蛋白。
GST融合蛋白已经发生降解
在裂解液中加入蛋白酶抑制剂,如加入1mMPMSF。
有可能是蛋白酶对目的蛋白部分降解造成的,可以使用蛋白酶缺陷型宿主菌(如Ion-或ompT)。
细胞破碎过度
减少细胞破碎时间,超声前加入溶菌酶(,25mMTris-HCI,),避免发泡导致蛋白变性,过度超声破碎增加宿主内源蛋白与GST融合目的蛋白的共纯化。
上柱后洗涤不充分
增加样品纯化环节第3)步平衡/洗涤缓冲液清洗柱床时间。
共价共纯化
包括促进蛋白正确折叠的分子伴侣的共纯化,如:DnaK(Mr〜70kD),DnaJ
(Mr〜37kD),GrpE(Mr〜40kD),GroEL(Mr〜57kD)和GroES(Mr〜10kD)。可尝试再次纯化改善。
目的蛋白与其他蛋白非特异性结合
在裂解液加入5mMDTT降低非特异性结合。
标签纯化类型
产品名称
产品特点
6His标签蛋白
纯化
FrdbioNiIDABeads
具有蛋白载量高,性价比高等优点。
FrdbioNiNTABeads
稳定,可以耐受一定浓度的还原剂、变性剂或耦合剂等苛刻条件。
FrdbioNiNTAkit
NiNTA预装柱,使用更方便。
FrdbioNiSuperbeads
新型的金属离子螯合填料,可以耐受非常苛刻的实验条件,镍离子脱落量低,咪唑使用浓度低,选择特异性高。
GST标签蛋白
FrdbioGlutathioneBeads
树脂载量大于20mgGST融合蛋白。GlutathioneBeads具有载
纯化
量高、特异性好、性价比高的特点。
FrdbioGlutathioneKit
GlutathioneBeads预装柱,使用更方便。
MBP标签蛋白
纯化
FrdbioDextrinBeads
带有麦芽糖结合蛋白(MBP)标签蛋白的亲和层析介质,可以用10mM麦芽糖进行温和洗脱。
FrdbioDextrinBeadskit
DextrinBeads预装柱,使用方便。
StrepII标签蛋
白
FrdbioStrep-TactinBeads
StrepII标签为8个氨基酸的小标签(WSHPQFEK)。
FrdbioStrep-TactinBeadskit
Strep-TactinBeads预装柱,使用更方便。