重组蛋白纯化sop.docx

大肠杆菌表达重组蛋白的超声破碎及纯化一可溶性蛋白的纯化(一)菌体的破碎 1. 仪器与材料: -80 ℃冰箱; 超声波细胞破碎仪; 50mM PBS 或 50mM Tris-HCl pH ; 50ml 离心管;冷冻高速离心机 反复冻融 收集菌液 500ml ,等分 10份, 4000 r/min 4℃离心 15min ,弃上清。 菌体沉淀中加入相同菌液体积的 50mM PBS 或 50mM Tris-HCl (选择使蛋白稳定的缓冲液和 pH )重悬洗涤一次。 然后按原菌液体积的 1/4 加入缓冲液重悬菌体,并加入蛋白酶抑制剂 PMS F 和 EDTA( 带 His 标签不加), PMSF 终浓度为 100 μ g/ml, EDTA 的终浓度为 (约为 58μ g/ml )。取 20μl 重悬菌液进行电泳, 检测蛋白表达的情况(是否表达,是可溶性表达还是包涵体表达)。 将菌液(经检测有表达)在-80 度冰冻,室温融解,反复冻融三次,由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀,使细胞结构破碎。 超声波处理( 对超声波及热敏感的蛋白慎用) 将反复冻融的菌液(必要时可加入 1mg/ml 溶菌酶,缓冲液 pH > ,加入后需静置 20min ),进行超声破碎,超声条件: 400W ,工作 5秒,间隔 5秒,重复一定次数, 直至菌体溶液变清澈为止。 取少量经超声破碎后的菌液, 10000rpm 离心 10分钟,分别对上清和沉淀进行检测,并用全菌作为阳性对照,检测菌体破碎程度及目标条带占总蛋白的含量。注意事项: (1)超声破碎具体条件可根据实验情况而定,要掌握好功率和每次超声时间, 降低蛋白被降解的可能。(2)功率大时,每次超声时间可缩短,不能让温度升高,应保持在 4度左右, 超声时保持冰浴。(3)菌体破碎后总蛋白浓度的测定可用 Bradford 法或者紫外吸收法。( 4)可通过 SDS-PAGE 电泳观察菌体破碎程度及目标条带占总蛋白的含量。 GST 融合蛋白的纯化以 PGEX 融合表达载体表达的 GST 融合蛋白, 可用谷胱甘肽-亲和层析介质纯化。 GE 公司的谷胱甘肽亲和介质是用 10个碳原子连接臂和谷胱甘肽作为配体连接到 4%交联的琼脂糖凝胶上,专门用于纯化谷胱甘肽 S-转移酶(GST )融合蛋白、其它的谷胱甘肽转移酶以及与谷胱甘肽有亲和作用的蛋白的亲和色谱填料。 1. GE 公司谷胱甘肽填料的性质: 基质 4% 的交联琼脂糖凝胶吸附载量 10mg GST 融合蛋白/ml 亲和填料的颗粒大小 90μm 最大流速 450cm/h pH 范围 3-12 使用温度常温保存温度+4~30 ℃保存液体 20% 乙醇化学稳定性室温 1M 乙酸盐, 6M盐酸胍条件下稳定 1h 实验过程中,可根据填料的吸附容量决定上样量,根据填料的其他特性保存填料 2 缓冲液及样品准备 缓冲液 Binding Buffer : PBS pH ( 140mM NaCl, mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, mM KH 2 PO 4) Elution Buffer : 50 mM Tris-HCl ,10 mM 还原型谷胱甘肽, pH 注:如有需要,结合及洗脱液中可加入 1-10 mM DTT 样品样品上柱前要于 10000rpm 下离心 10 分钟或经 μm 的滤膜过滤后才能上样。如果进行批量纯化时可不必过滤。若样品黏度较大,可用结合缓冲液适当稀释。 3 批量纯化 介质的准备(1) 取 1mlGST 琼脂糖凝胶制成 50% 混悬液(2) 用移液管转移到离心管里 500 ×g离心 5min ,小心倾去上清。(3) 加入 5ml PBS 混匀介质进行洗涤。(4) 500 ×g离心 5min 沉淀介质,小心倾去上清。(5) 重复洗涤一次。 批量纯化(1) 向 GST 琼脂糖凝胶里加入细胞裂解液( 根据目的蛋白表达量和介质的吸附容量决定上样量),轻轻混匀,使 GST 融合蛋白与还原型谷胱甘肽的充分结合, 4 度旋转孵育 3小时(可进行实验确定)。(2) 用吸管将混合物转移到另一离心管中, (3) 500 ×g离心 5min 沉淀介质,小心倾去上清,取 20μl 上清液(即流穿液)进行 SDS-PAGE 以分析介质的结合效率。(4) 加入 5ml PBS 混匀,洗涤。(5) 500 ×g 离心 5min 沉淀介质,小心倾去上清(洗涤液) ,取 20μl 上清液 SDS-PAGE 分析。(6) 重复步骤 4、5两次。(7) 加入 Elutio