重组蛋白纯化SOP.docx

重组蛋白纯化SOP
大肠杆菌表达重组蛋白的超声破裂及纯化
一 可溶性蛋白的纯化 〔一〕菌体的破裂
1. 仪器与材料：-80℃冰箱；超声波细胞破裂仪；50mM PBS或50mM Tris-H
(1) 向GST琼脂糖凝胶里参加细胞裂解液〔依据目的蛋白表达量和介质的吸附容量确定上样量〕，轻轻混匀，使GST融合蛋白与复原型谷胱甘肽的充分结合，4度旋转孵育3小时〔可进展试验确定〕。
4%的交联琼脂糖凝胶 10mg GST融合蛋白/ml 90μm 450cm/h 3-12 常温 +4~30℃ 20%乙醇 室温1M乙酸盐，6 M盐酸胍条件下稳定1h 试验过程中，可依据填料的吸附容量确定上样量，依据填料的其他特性保存填料
(2) 用吸管将混合物转移到另一离心管中，
(3) 500×g 离心5min 沉淀介质，当心倾去上清，取20μl上清液〔即流穿液〕进展SDS-PAGE以分析介质的结合效率。 (4) 参加5ml PBS 混匀，洗涤。
(5) 500×g 离心5min 沉淀介质，当心倾去上清〔洗涤液〕，取20μl上清液SDS-PAGE分析。 (6) 重复步骤4、5两次。










(7) Elution Buffer，轻轻混匀，室温孵育20min。 (8) 500×g 离心5min 沉淀介质，当心收集上清〔洗脱液〕。
(9) 重复步骤4、5两次，分别检测三次洗脱上清中目的蛋白的含量，依据结果合并含量较多的上清液。 留意事项
(1) GST融合蛋白与复原型谷胱甘肽的结合比拟缓慢，为了获得最大的结合量，很重要的一点就是保证足够作用时间。不同的GST融合蛋白结合效率会有很大不同。
(2) 对不同GST融合蛋白，洗脱体积和洗脱时间会有所不同，可能会须要更高浓度的复原型谷胱甘肽。假如须要的话，须要对流穿液、洗涤液及洗脱液进展SDS-PAGE以及Western blot分析。
(3) GST融合蛋白的浓度可以通过bradford法或紫外分光光度法来确定。假如用Lowry 或者BCA分析，样品须要先利用脱盐柱或超滤进展缓冲液交换处理或透析处理。以除去其中的复原型谷胱甘肽，因为复原型谷胱甘肽的存在会干扰BCA和Lowry测定。
(4) GST琼脂糖凝胶能否重复利用要依据样品来定，而且只能用来处理同一种样品，以防止穿插污染。 4 柱纯化 装柱
(1) 全部试剂耗材的温度应调整到纯化时的温度。
(2) PBS脱气后从柱底下出口管朝柱内注入，使柱底全部充溢水而不留气泡，柱底预留10%柱体积的缓冲液，关闭柱下端出口。
(3) 将洗好的介质用PBS重悬成60%的混悬液，轻轻搅动凝胶溶液，使形成均一的薄胶浆，并马上倒入层析管内，让参加的凝胶在柱内自然沉降。 (4) 马上将层析柱用PBS缓冲液充溢，装好柱上端接口并连接上蠕动泵。 (5) 翻开柱子下端出口，并调高泵的流速为15ml/min，让介质在不高于1bar()的恒定压力下压紧。










(6) 当柱床体积恒定不变后接着以一样流速至少平衡3个柱床体积，并标记柱床
高度〔纯化过程中流速不得超过压紧介质流速的75%〕。
(7) 停顿蠕动泵，柱内液面缓慢下降，直到稍高于凝胶界面，关闭柱下端出口。柱下端出口连接上细塑管。 柱纯化
(1) 介质平衡：用10倍柱床体积的Binding Buffer 平衡柱子，流速1ml/min。或始终平衡直到紫外检测仪基线走平。
(2) 上样：关紧螺旋夹，用毛细吸管当心吸去凝胶层面上的缓冲液至凝胶层面与缓冲液液面齐平。将样品离心或过滤后，用吸管当心沿柱壁缓缓参加柱内。轻开螺旋夹，使柱中缓冲液缓缓流出，让样品溶液进入凝胶，至与凝胶层面齐平。柱壁用少量PBS缓冲液当心洗涤2-3次，重复至使缓冲液液面与凝胶层面齐平。 (3) 洗杂：上样后用8倍柱床体积的Binding Buffer冲洗层析柱，流速1ml/min或用Binding Buffer始终冲洗到流出液中无杂蛋白流出，取20μl