实验八鸡红细胞融合.pptx

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一、实验目的
,理解体细胞融合原理
,并观察细胞融合过程。
二、实验原理
细胞融合(cellfusion)或细胞杂交(cellhybridization)是指真核细胞通过介导和培养,两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程。
目前,诱导细胞融合的方法有三种:病毒(Okada,1958)、聚乙二醇(polyethyleneglycol,PEG)(Pontecorvo,1975)和电激(Zimermann,1980)。
PEG能改变各类细胞的膜结构,使两细胞相互接触部位的膜脂双层中磷脂分子发生疏散、进而使其结构发生重排,再加上膜脂双层的相互亲合以及彼此间表面张力的作用,引起两个细胞邻接位置的重排质膜在修复时相互合并在一起,使两细胞的胞质沟通,从而造成相互接触的细胞之间发生融合。
三、实验用品
1器材:
离心机,水浴锅,普通光学显微镜;量筒,滴管,刻度离心管,等。
2材料:新鲜鸡血
3试剂
Alsever液,,,。加重蒸水至100mL。
%生理盐水,
GKN液:氯化钠8g,,,,葡萄糖2g,,溶于1000mL重蒸水中。
Ringer溶液:,,(),溶于1000mL蒸馏水中。
Hanks液:(另溶解),,,,,,,D-,。按顺序依次逐一完全溶解,用时氯化钙和其余混合,共计100mL。
50%PEG混合液:称取适量PEG(4000)放人刻度离心管沸水浴中加热溶化,待冷却至50℃时,加入预热至50℃的等体积的GKN液,混匀。注意使用前配制,PGE有毒避免沾染皮肤。
四、实验步骤
将Alsever液与新鲜鸡血4:1混成悬液(抗凝效果最佳)
↓
取上述悬液按1:4加入生理盐水混匀
↓
1500r/min,离心5分钟(重复洗涤2次,去除细胞表面粘附物质)
↓弃上清
加入适量GKN液,配成细胞悬液(10%)
↓
取悬液以血球计数法计数(红细胞15万~20万个/ml,可用GKN稀释)
↓
加入50%的PEG液混匀(1mL悬液,~%PEG混匀,置于37℃水浴中温浴2~10min;
↓加Ringer或Hanks终止
吸取1~2滴镜检(%次甲基蓝1滴),并计算出融合率
五、实验结果
经PEG处理后,在显微镜下,可观察到未融合的单核细胞、融合后的双核细胞和融合后的多核细胞。绘图说明各个时期。细胞融合后可观察到哪几种类型的细胞?
细胞融合率是指在显微镜的一个视野内,已发生融合的细胞核总数与该视野内所有细胞(包括已融合的细胞)的细胞核总数之比,通常以百分比表示。多个视野计数再平均
六、讨论
血细胞悬液密度与融合率的关系?
查阅近期资料,了解如何提高融合率?
本实验为什么用鸡血?