微生物大实验实验报告 (自动保存的).docx

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中央民族大学生命与环境科学学院
微生物综合性设计实验报告
化学抑杀菌剂的效果评价
Evaluationofbactericideeffectofchemicalinhibition
姓名:
杨芳
学号:
1245015
年级:
12级
专业:
生物科学类一班
小组成员:
胡雪辰、付国松、王新凯
指导教师:
李崴
2023年11月30日
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卡那霉素、氨苄青霉素和四环素对细菌抑杀效果的评价
杨芳
〔中央民族大学生命与环境科学学院北京100081〕
摘要:目的了解抗生素对微生物生长的影响,学习抗菌谱试验的根本方法;自主设计方案,掌握评价化学抑杀剂作用效果方法;掌握评价化学抑杀剂作用效果方法。方法本实验主要采用倾注法测菌悬液浓度、滤纸片法测定抗生素的最小抑制浓度〔MIC〕及pH值对抗生素作用效果的影响和t检验法对实验结果进行统计学分析。Í107CFU/mL、Í107CFU/mL;对大肠杆菌卡那霉素、、/mL,对枯草芽孢杆菌卡那霉素、、/mL;卡那霉素对大肠杆菌为杀灭作用,对枯草芽杆菌为抑制作用、四环素对大肠杆菌为抑制作用,对枯草芽孢杆菌为杀灭作用、青霉素对枯草芽孢杆菌为抑制作用,因大肠杆菌出现抗性,所以青霉素对大肠杆菌的作用不明显。结论对同一药剂,低浓度的药剂对细菌抑杀效果不明显而随着浓度的增大其抑杀效果越来越明显;同一浓度的同一药剂对不同细菌有不同的抑杀效果;不同药剂对同一细菌的抑杀效果是不同的。
关键字:最小抑制浓度;抗生素;大肠杆菌;枯草芽孢杆菌
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Kanamycin,ampicillinandtetracyclineevaluationoftheinhibitionofbacterialkillingeffects
Yangfang
(Collegeoflifeandenvironmentalscience,MinzuUniversityofchina,Beijing,100081)
Abstract:Objectiveunderstandtheimpactofantibioticsonmicrobialgrowth,learnbasicmethodsofspectrumantimicrobialtesting;designindependently,masterevaluateeffectsofchemicalagentstokillsuppressionmethods;,filterpaperassayantibioticminimuminhibitoryconcentration(MIC)andtheeffectofpHontheeffectsofantibioticsandt-Í107CFU/mL,Í107CFU/,ampicillinandtetracyclineMICwas
,/,kanamycin,,/mL;,,penicillinistheinhibitionofBacillussubtilis,Escherichiacolioccurduetoresistance,,alowconcentrationofdrugsuppressionkilllittleeffectonbacteriaandwiththeincreasingconcentrationofitssuppressionkillmoreandmoreobviouseffect;samedruginthesameconcentrationofdifferentsuppressionkillbacteriahavedifferenteffects;differentagentsofthesamesuppressionofbacterialkillingeffectsaredifferent.
Keywords:MIC;Antibiotic;;Bacillussubtilis
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一、引言:
:
,学习抗菌谱试验的根本方法;
,学以致用;
,通过滤纸片法研究一些常用抗生素的抑杀菌效果,掌握评价化学抑杀剂作用效果方法;
;
;
。
:

在人们日常生活中常用到各种抗病原体药物,包括各种抗生素和中药类复方抗菌药物等。
抗生素是由微生物〔包括细菌、真菌、放线菌属〕产生、能抑制或杀灭其他微生物的物质。抗生素既不参与细胞结构也不是细胞内的贮存性养料对产生菌本身无害但对某些微生物有拮抗作用,是微生物在种间竞争中战胜其他微生物保存自己的一种防卫机制。
抗生素分为天然品和人工合成品,前者由微生物产生,后者是对天然抗生素进行结构改造获得的局部合成产品。
:
氨苄青霉素:抑制细胞壁中肽聚糖的合成;
卡那霉素:一种蛋白质生物合成抑制剂,通过与30S核糖体结合从而致使mRNA密码误读;
四环素:与核蛋白体的30S亚单位结合,而阻止氨酰基tRNA同核蛋白体结合,从而抑制肽连的增长和影响细菌蛋白质的合成;
:
抗生素那么能选择性地作用于菌体细胞DNA、RNA和蛋白质合成系统的特定环节,干扰细胞的代谢,阻碍生命活动或使停止生长甚至死亡抗生素的抗菌活性主要表现为抑菌、杀菌和溶菌三种现象。抗生素抗菌作用的表现与使用浓度、作用时间、敏感微生物种类以及周围环境条件都有关系。
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抗生素的作用具有选择性,不同抗生素对不同病原菌的作用不一样。对某种抗生素敏感的病原菌种类称为该抗生素的抗生谱〔抗菌谱〕。
广谱抗生素对多种病原菌有抗生作用,例如青霉素对多种革兰氏阳性细菌都有良好药效,链霉素对多种革兰氏阳性和阴性细菌都有良好药效,对结核杆菌有特殊的疗效。
有效作用浓度。各种抗生素一般都在很低浓度下对病原菌就发生作用,这是抗生素区别于其他化学杀菌剂的又一主要特点。
各种抗生素对不同微生物的有效浓度各异,通常以抑制微生物生长的最低浓度作为抗生素的抗菌强度简,称有效浓度。有效浓度越低,说明抗菌作用越强。
有效浓度在100mg/L以上的属于作用强度较低的抗生素;
有效浓度在lmg/L以下是作用强度高的抗生素。
:
抑制细胞壁合成〔青霉素、头孢菌素、杆菌肽〕;
干扰细胞膜〔多粘菌素〕;
抑制蛋白质合成〔与50S〔30S〕核糖体结合,氯霉素,红霉素〕;
抑制DNA复制〔丝裂霉素〕;
抑制RNA转录或合成〔放线菌素D、利福平〕。
〔包括抗菌药物〕的抗药性的4种机制
使抗生素分解或失去活性:细菌产生一种或多种水解酶或钝化酶来水解或修饰进入细菌内的抗生素使之失去生物活性。
使抗菌药物作用的靶点发生改变:由于细菌自身发生突变或细菌产生某种酶的修饰使抗生素的作用靶点〔如核酸或核蛋白〕的结构发生变化,使抗菌药物无法发挥作用。
细胞特性的改变:细菌细胞膜渗透性的改变或其它特性的改变使抗菌药物无法进入细胞内。
细菌产生药泵将进入细胞的抗生素泵出细胞:细菌产生的一种主动运输方式,将进入细胞内的药物泵出至胞外。

传统中药在维系人们的健康中发挥重要的作用。其中一些药物具有较强抗菌活性被人们所选用。
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如双黄连〔金银花、黄芩、连翘〕是一种理想的抗病毒及细菌感染的中药新剂型,清热解毒。用于风热感冒发热,咳嗽,咽痛。
消炎利胆片〔穿心莲、溪黄草、苦木〕,清热、祛湿、利胆。用于肝胆湿热引起的口苦、肋痛;急性胆囊炎、胆管炎。

黄连素是一种重要的生物碱,是我国应用很久的中药。可从黄连、黄柏、三颗针等植物中提取。它具有显著的抑菌作用。常用的盐酸黄连素又叫盐酸小檗碱。黄连素能对抗病原微生物,对多种细菌如痢疾杆菌、结核杆菌、肺炎球菌、伤寒杆菌及白喉杆菌等都有抑制作用,其中对痢疾杆菌作用最强,常用来治疗细菌性胃肠炎、痢疾等消化道疾病。临床主要用于治疗细菌性痢疾和肠胃炎,它无抗药性和副作用;

通过杯碟法〔管碟法〕、滤纸片法〔琼脂扩散纸片法〕、石炭酸系数法及生长曲线测定等方法鉴定不同抑杀菌剂的作用效果;
同时采用杯碟法〔管碟法〕、滤纸片法〔琼脂扩散纸片法〕还可以检测物品〔如食品中〕是否含有化学抑杀菌剂;

〔1〕滤纸片法适用条件:不易挥发的化学药剂;
〔2〕滤纸片法工作原理:利用滤纸作为药剂的承载体,放置于含有待检测菌种的平板上,使药剂在琼脂中扩散,在不同浓度下对细菌的抑菌效力不同,产生可见的抑菌圈。测定抑菌圈直径大小,抑菌圈直径大越大,该药剂的杀菌能力越强;
〔3〕滤纸片法考前须知:
滤纸片大小一致〔6mm,选用打孔器获取〕;
滤纸片吸附量一致〔以移液器量取20-40μL,可以采用2-4片叠加吸附,增加吸附剂量〕
菌量控制合理,以形成菌苔〔107-109cfu/mL);

〔1〕适用条件:不易挥发的化学药剂;
〔2〕工作原理:将牛津杯放置于含有待检测菌种的平板上,将试验药剂参加牛津杯中〔200μL〕,当药剂在琼脂中扩散,在不同浓度下对细菌的抑菌效力不同,产生可见的抑菌圈。测定抑菌圈直径大小,抑菌圈直径大越大,该药剂的杀菌能力越强;
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〔3〕考前须知:
牛津杯放置要平;
加药剂量一致〔以移液器量取〕;
菌量控制合理,以形成菌苔〔107-109cfu/mL);


在一定范围内,微生物细胞浓度与透光度呈反比与光,密度呈正比。而光密度或透光度可以通过光电池测出;

采用倾注法或涂布法进行活菌计数
二、实验材料、仪器、试剂
:
大肠杆菌菌种〔G-〕、枯草芽孢杆菌菌种(G+);

高压蒸汽灭菌锅、鼓风枯燥箱、移液器、涂布棒、平板、试管、酒精灯、打孔器、三角瓶、微波炉、培养皿、镊子、线绳、烧杯、玻璃棒、试管塞等;
:

表1牛肉膏蛋白胨培养基的配方
Table1Recipebeefextractpeptonemedium
成分
牛肉膏
蛋白胨
NaCl
琼脂
水
含量
3g
10g
5g
18g
1000mL
~℃灭菌20min

生理盐水
100mg/mL氨苄青霉素、卡那霉素、四环素母液各1mL(配好的抗生素溶液应冷藏保存)三、实验方法


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〔1〕按照牛肉膏蛋白胨培养基的配方配制牛肉膏蛋白胨培养基350mL,分装在六个试管〔约为试管体积的1/3用于扩繁菌种〕和几个锥形瓶中,并进行包扎;
〔2〕配制200mL的生理盐水,分装在12个试管〔每支试管中用移液管准确量取9mL〕中,剩下的生理盐水装在锥形瓶中,并进行包扎;
〔3〕取两只涂布棒和足量两种移液器的针头进行包扎;
〔4〕用打孔器打约300个滤纸片并进行包扎;
〔5〕将上述包扎所得在高压蒸汽灭菌锅中灭菌〔在121℃温度下灭菌20min〕;
〔6〕将无菌操作台的紫外灯翻开灭菌,计时20min后放气,以备用;

〔1〕将灭菌的培养基倒入6支试管中,倒入试管中培养基的体积约为试管体积的1/3,制作斜面;
〔2〕每三支试管扩繁一种菌,用接种环挑取菌种,在斜面上接种;
〔3〕将接种好的细菌放入恒温培养箱中进行培养,以用于接下来的实验;

〔1〕,并准备好灭过菌的平板;
〔2〕将装有培养基的试管放在一根玻璃棒上制备斜面并进行标记,每三支试管标记为一种菌;
〔3〕将接种环在酒精灯上灼烧,待温度适宜,挑取一环菌接种在斜面上,并与标记菌命相对应;重复此操作至接种完六支试管,将所新接菌种放入37℃恒温培养箱中进行培养;
〔4〕待锥形瓶内的生理盐水冷却至室温,向有菌种的试管中放入大约5mL的生理盐水,作为10-1稀释度菌悬液;
〔5〕对每种菌的10-1稀释度菌悬液进行稀释,具体的稀释过程如图1所示;
1mL1mL1mL1mL1mL
10-110-210-310-410-510-6
图1菌悬液稀释示意图
Figure1Schematicdilutedbacterialsuspension
〔6〕用移液器取每种菌的每种浓度〔从10-2至10-6〕的稀释液1mL放于每一平板中,并做好标记,每种菌的每种浓度的稀释液有两个平板做平行试验,将适宜温度的培养基倒入平板中
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〔每个平板约15mL〕;
〔7〕将上述20个平板倒置放入37℃恒温培养箱中培养24h;

〔1〕按照牛肉膏蛋白胨培养基的配方配制培养基400mL,并分装在锥形瓶中,进行包扎灭菌;
〔2〕配制适量生理盐水与锥形瓶中进行包扎灭菌;
〔3〕将三种抗生素原液进行二倍稀释,%无菌生理盐水为稀释液,得100μg/mL,50μg/mL,25μg/mL,,;
〔4〕取出扩繁的大肠杆菌及枯草芽孢杆菌各一支,向其中参加温度适宜的生理盐水〔约5mL〕;
〔5〕将灭过菌培养基倒入平板中〔每个平板大约15mL〕,吸取每种菌种的菌悬液200μL于每个平板中〔每种菌有九个平板〕,用涂布棒进行涂布接种;
〔6〕在无菌环境下,用移液器吸取30μL稀释好的各浓度的抗生素溶液湿润滤纸片〔2层滤纸片叠在一起〕,将滤纸片贴在含有待检测菌种平板上,不同浓度的同一种抗生素贴在一个平板上,每种抗生素再做两组平行试验,平板中间贴上对照组〔生理盐水〕,故一个平板上贴6个滤纸片〔5+1〕,做上标记;
〔7〕将平板倒置放入37℃恒温培养箱中培养24h;
〔8〕观察记录前一天实验的抑菌圈的大小,以出现的最小抑菌圈〔〕的浓度作为MIC,,重复以上七步,并进行观察,以至于得到各种抗生素的最小抑制浓度;
〔表现为抑制或者杀灭〕
〔1〕将抑菌圈大小适宜的一组平板的滤纸片接下,并放入37℃恒温培养箱中培养24h;
〔2〕观察实验结果,假设原抑菌圈中出现新的菌落那么说明该抗生素对该菌的作用效果为抑制作用,假设原抑菌圈中未出现新的菌落组说明该抗生素对该菌的作用效果为杀灭作用;

〔1〕pH选5、6、7、8、9进行最适pH的选取;
〔2〕选用抑菌效果最好的抗生素卡那霉素,将抗生素的的pH分别调至5、6、7、8、9五个点;
〔3〕倒3个平板,用涂布法接种枯草芽孢杆菌3个平板;
ofruraldrinkingwatersources,protectionofdrinkingwatersour