蓝白筛选.pdf

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编辑词条
目录
实验材料介绍
实验原理
实验干扰
相关实验方法
蓝白筛选是在指示培养基上用颜色直接筛选重组克隆的方法。
编辑本段实验材料介绍
1)载体质粒和转化受体菌株:
实验所使用的载体质粒DNA为pBS,。
-半乳糖苷酶C端部分序列的编码信息。
载体质粒DNApBS上带有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和β-半乳糖苷酶
N端146个氨基酸的编码序列。(这个编码区中插入了一个多克隆位点,但并没有破坏
lacZ的阅读框架,不影响其正常功能。)
在各自独立的情况下,pBS和DH5α编码的β-半乳糖苷酶的片段都没有酶活性。
但在pBS和DH5α融为一体时可形成具有酶活性的蛋白质。
这种lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的
β-半乳糖苷酸阴性突变体之间实现互补的现象叫α-互补。
2)实验用显色方法
实验中使用X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)和IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳
糖苷)而非直接使用β-半乳糖。
X-gal以及β-半乳糖均为β-半乳糖苷酶底物,但是X-gal不能诱导β-半乳糖
苷酶操纵子。
实验中使用IPTG以诱导β-半乳糖苷酶操纵子。
X-gal在β-半乳糖苷酶作用下生成深蓝色产物。
编辑本段实验原理
1)初步筛选
载体质粒DNApBS上带有Ampr基因而外源片段上不带该基因,故转化受体菌后
只有带有pBSDNA的转化子才能在含有Amp的LB平板上存活下来;而只带有自身环
化的外源片段的转化子则不能存活。此为初步的抗性筛选。
2)蓝白筛选
当外源片段插入到pBS质粒的多克隆位点上后会导致读码框架改变,表达蛋白
失活,产生的氨基酸片段失去α-互补能力,含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上
只能形成白色菌落。
而
没有重组质粒的转化子产生α-互补,在生色底物X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半
乳糖苷)下存在下被IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)诱导形成蓝色菌落。
编辑本段实验干扰
在实际操作中,蓝白筛选出现是浅蓝色重组子的原因是:插入小片段时,质粒仍
可以表达有缺陷N-末端a肽与B连互补形成活力有缺陷的半乳糖苷酶重组子形成浅
蓝斑。即而出现假阴性。
氯化钙法转化:
最近我们也在作感受态细胞转化
做转化时一定要注意用冷的氯化钙,还可以在加入后42度热休克90秒,这样效果比较好。
筛选时我们用的质粒中有氨卞霉素的抗性,所以只是在培养基中加入氨卞霉素就成了。但是蓝白筛选不是
白色的是转入质粒的么?篮斑是没转入的啊。
电击的时候要求溶液要有一定的电阻,这样才能维持一定的电压、较低的电流和长一点的电击时间,如果
含有氯化钙,就会增大溶液的导电性,电击时电流过大会使细菌受到伤害,所以电击液里要严格控制电解
质的浓度。
加入甘油是为了保护细菌在冰冻储存的时候不至于受到太大伤害,它可以减少细胞内小冰晶的形成。