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第一章地衣共生菌藻的分离与培养
地衣是一种真菌,由地衣共生菌和一种藻类或蓝细菌(蓝藻)的共生而形成的联合体,属“二元”生物体。在这个二元共生联合体中,真菌菌丝缠绕大量的光合细胞。在上述地衣的定义我们可以提出这样的一个问题:地衣是否可分为单个生物体?地衣生物学研究的许多方面均涉及到这些不同有机组织的相互作用。对于共生体的分离和培养研究,为科学家对于地衣共生关系本质的探讨提供了迷人的前景。该研究的中心问题是地衣光合共生物以及地衣共生菌的培养,这也是解决地衣生理、形态、发育和分子生物学等方面研究的根本问题。
地衣共生体的培养曾经被认为难以进行,这主要是因为这是一项很耗时的工作,而且共生体的培养是否成功需要长期的技术探索。然而,Ahmadjian(1967b)突破性的研究引起了许多地衣学者对共生菌藻培养的兴趣。在过去的二三十年间,关于地衣共生菌藻的研究和地衣的人工重建已取得了相当的成就,如图一所示,地衣共生菌藻培养可以通过各种不同的方法而实现。
地衣共生体的培养很难,即使用具富营养的培养基。主要是因为共生菌的生长远远快于共生藻或蓝细菌。此外,霉菌、酵母菌和细菌等的污染也是很重要的因素。因此在所有的操作过程中要进行无菌操作以
防污染。
本章的目的在于讲述从地衣中分离出共生菌藻并进行培养的方案。子
方案I讲述了地衣共生菌培养的各种方法。子方案II讲述了地衣共生藻培养的各种技术。这些培养技术已有报道,但我们在此研究的基础上又添加了一些新的内容。
关于共生体的分离技术已有Ahmadjian(1967a,b)和Galum(1988)全面的描述了。
子方案I 共生菌的培养
注意:除了每一个清洗步骤,所有的操作都应在超净工作台上或无菌的条件下进行。所有的仪器在用之前都应高压灭菌(15~20分钟,121℃,1 atm)或干热灭菌(30分钟,180℃)。
一、仪器与材料
仪器:显微镜、解剖镜、相差显微镜、高压灭菌锅、培养箱、超声波发生机、离心机、超净工作台或无菌工作室。
真菌来源:我们建议所用的地衣应为野外新采集的而且在一周内利用。然而地衣也可以在干燥状态下保存几周,或在冰箱内存放几年(Yoshimura et al. 1990)。共生菌可以从子囊孢子、分生孢子、裂芽、粉芽和菌体碎片中分离出来(Ahmadjian 1993)。
用来实验室培养最常见的共生菌分离方法是:孢子释放法,主要是子囊孢子。获得共生菌藻的另一个方法是解剖菌体切片,这样会形成大量较纯的共生菌,在第二章我们将详细介绍从菌体碎片中获得共生菌和藻的方法。
保存在Akita profectue University和Kochigakuen college的培养真菌可见表1。
(P7-13)。
真菌培养基:
Ahmadjian(1993)和Pyatt(1973)建议用来孢子收集和萌发的培养基应含营养量低。可在15℃黑暗条件下,采用含水4%的琼脂培养基以取得了较好的效果。这类共生菌的培养基如下:
WA4培养基——含4%蒸馏水的琼脂培养基
琼脂 4克蒸馏水补足100ml
MY培养基——麦芽酵母提取物培养基(ahmadjian 1967 a)
麦芽提取物 20克酵母提取物 2克
琼脂 20克蒸馏水蒸馏水补足1000ml
LB培养基——Lilly and t’ s培养基(t 1951)
葡萄糖 (Asparagine)
KH2PO4 MgSO4?7H2O
Fe(NO3)3?9H2O mg ZnSO4?7H2O
MnSO44H2O 维生素B1(Thiamine)
维生素H(Biotin) 5ug 蒸馏水补足 100ml
可以在以上组分上加入15~20g的琼脂,并补足 1000ml,并制成固体培养基。
LBG 培养基——Lilly and t’s Gelrite 培养基
LB培养基中以1%的w/v Gelrite 代替琼脂。
注意:在利用和倒入皮氏培养皿(5mm)或试管(5ml)之前,应将所有培养基进行灭菌。
二、实验步骤
(一)通过孢子分离出共生菌
孢子释放:
,放置几天使其于周围环境达到水分平衡。也可以将材料清洗和冷冻,在用之前平衡几个小时。
,并将其在放有蒸馏水的培养皿中浸泡4小时或在流动水中清洗。
通过挤压去除多余的水分。
,然后用含水4%的琼脂培养基盖在培养皿上部,将培养基放在培养皿的上面盖上,并防止琼脂污染。