SOD实验资料 (2).doc

SOD实验资料(2)
超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定淡蓝四唑(NBT)法
一、实验目的
1、了解氮蓝四唑(NBT)法测定植物体内超氧化物歧化酶(SOD)活性的基本原理。
2、掌握氮蓝四唑(NBT)法测定植物体内超氧化物歧化酶(SOD)活性的基本操作方法。
二、实验原理
超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)普遍存在于动、植物体内,是一种清除超氧阴离子自由基的酶。本实验依据超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑(NBT)在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下,核黄素可被光还原,被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生超氧阴离子自由基,超氧阴离子自由基可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙,后者在560nm处有最大吸收。而SOD可清除超氧阴离子自由基,从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后,反应液蓝色愈深,说明酶活性愈低,反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。
三、材料、仪器设备及试剂
(一)材料
香梨树的树皮
(二)仪器设备
Anke GL_20G_II高速冷冻离心机,UV-2102 C 型紫外可见分光光度计,
MODEL:ST-150P光照培养箱,微量进样器,恒温水浴锅,研磨工具,离心管,容量瓶,烧杯,试管或指形管数支。
(三)试剂
(1)()。 Na2HPO4+
Mol/L NaH2PO4 。
(2)130mmol/L甲硫氨酸(Met)溶液:。
(3)750μmol/L氮蓝四唑溶液:,避光保存。
(4)100μmol/LEDTA-Na2溶液: EDTA-Na2,用磷酸缓冲液定容至1000ml。
(5)20 μmol/L核黄素溶液:,避光保存。
四、实验步骤
1、酶液提取
取一定部位的香梨树树皮(取韧皮部),加5ml预冷的磷酸
缓液在冰浴上研磨成浆,加缓冲液使终体积为5ml。取5ml于4℃10000r/min离心20min上清液即为SOD粗提液。
2、显色反应
取10mL试管(要求透明度好)4支,2支为测定管,另2支为对照管,
按下表加入
各种溶液: 各溶液显色反应用量混匀后将1支对照管置暗处,其他各管于4000lx日光下反应20min(要各管受光情况一致,温度高,时间缩短,低时延长)。
3、SOD活性测定与计算
至反应