实验提取SOD.docx

超氧化物歧化酶SOD的分离纯化技术
摘要通过对绿豆种子的研磨破碎获得SOD粗酶,经过硫酸铵分级分离、透析除盐和浓缩等过程,除去粗酶液中的杂质及干扰蛋白,采用葡聚糖(Sephadex G-100)凝胶层析得到纯化的SOD酶。跟踪提纯过程活性的分布,并评价提取过程各步骤的效率。实验结果证实随着不断的分离提纯,总活力不断减小,比活力不断上升,,%。

前言
超氧化物歧化酶(superoxide dsdismutase,SOD)是需氧化物中以超氧阴离子为底物的一种酶,广泛存在于各种生物中。SOD不仅在生物体内对抗氧化、解毒起重要作用,也有延缓机体衰老、抗肿瘤及抗免疫性疾病等功能,因而受到极大关注。
SOD属于金属酶,其理化性质不仅取决于蛋白质部分,而且还取决于结合到活性部位的金属离子。按照结合的不同金属离子,生物体中SOD有Cu、Zn-SOD、Mn-SOD和Fe—sOD三种,但近几年发现低等生物中尚存在含Ni的SOD。在已发现的酶中,超氧化物歧化酶(SOD)是需氧生物和耐氧生物的体内清除超氧化物自由基的酶超氧自由基在体内的过多积累将可能引发脂质过氧化损伤DNA,使脱水酶失活,使线粒体中的NADH脱氢酶NADH氧化酶磷酸腺苻酶(ATPase)失活,从而易引起生物体发疾病或衰老。
ord与Fridovich发现 SOD及其催化超氧化物自由基歧化为 O2 与H2O以来,SOD一直以來被认为是生物体内最重要的抗氧化酶。根据近10年的研究报告表明,SOD具有清除超氧化物自由基,防止其对机体直接或间接的损伤;使O2成为细胞内自由基的排污漕;调节机体内O 的水平;调节机体内NO水和催化反应产物H2 O2等作用。现在在日常生产应用中,多以动物血液中提取SOD。但是动物血液中的疾病很多,价格也比较昂贵。从植物中提取SOD就可以相应的解决上述问题,类似绿豆芽这种植物,其成本低廉,且SOD的含量丰富,又无污染,将其大量应用于生产有着很好的发展前景。
实验材料与方法:
<一>材料:绿豆种子,市售新鲜绿豆种子浸泡蒸馏水24小时备用.
<二>试剂:葡聚糖(sephadexG-100或G150), NaCl(AP), 磷酸氢二钠(AP), 磷酸二氢钠(AP), 三羟甲基氨基甲烷(Tris), 盐酸(浓盐酸),硫酸铵(AP), PEG6000, 考马斯蓝G250 , 磷酸,乙醇(AP) , 牛血清蛋白BSA , 连苯三酚(焦性没食子酸), 甲硫氨酸( methionine) , NBT(氮兰四唑 Nitroblue Tetrazdinna), 核黄素, EDTA(钠盐) , 超氧化物歧化酶(sigma公司),
<三>仪器:
离心机
WFZ-UV2000 型紫外分光光度计
201×7(717)强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂
匀浆机、各型号烧杯、试管、量筒、带毛塞试管、漏斗、移液枪、移液管、玻璃棒、
<四>实验方法和步骤:
称量25g 绿豆+250ml pH7 mol/L pb液,匀浆,两层纱布过滤,离心(3000rpm)15Min 取清液,取少量样为样①,测量SOD活性、蛋白质含量测量,计算SOD总活性单位及活性单位。
所得清液测量总体积,缓慢40%饱和(NH4)2SO4