细菌16SrDNA测序鉴定.doc

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一、细菌总DNA提取
二、16SrDNA的扩增
1、以单菌落或菌悬液为模板的16SrDNA扩增体系
25ul体系2+Buffer(含有Mg):
dNTP::,3-primer:,5-primer:
模板:1个单菌落(或1ul在LB培养液中37?,12h的菌悬液)吐温20:2ul
:
水:()
细菌16SrDNA的通用引物为Pf-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG和Rf-TACCTTGTTACCACTT
许敬亮博士论文66页:扩增采用通用的引物,其正向序列为:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3',反向互补序列为:5'-TTCAGCATTGTTCCAT-3'。
黄婷婷博士论文70页:5’端:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'
(Escherichiacolibases8to27),
3’端:5'-TACCTTGTTACGACTT-3'(Escherichiacolibases1507to1492)。2、以总DNA为模板的16SrDNA扩增体系
25ul体系2+Buffer(含有Mg):(购买)
dNTP::,3-primer:,5-primer:
模板:1ul
Taq酶:()
双蒸水:()
3、PCR反应条件
94?,5min;95?,变性30s;50?,52?(可根据扩增情况进行适当调节),退火30s;72?,延伸1min;30个循环;72?,延伸15min;10?(or4?),保温10min(ornh)。
4、检测扩增效果
取1,3ul扩增产物,适量loadbuffer,以DL2000为Marker,%琼脂糖凝胶跑电泳(电压挑低些80,100,胶长些,利于各扩增产物分离及回收切胶)注:扩增条件摸索时每个模板只扩1管即可
三、16SrDNA的回收
%琼脂糖凝胶电泳检测后,将效果好的各管
,100ul样量,100ul16SrDNA+10ul溴酚蓝跑电泳回收胶16SrDNA合并使达到60
(电泳液需换成新鲜的,DL2000为Marker),(离心管事先称重),按DNA凝胶回收试剂盒操作说明回收16SrDNA,取回收16SrDNA2ul(Dl2000为Marker)跑电泳观察浓度(亮度)与纯度(条带数与位置)。
注:回收后的16SrDNA可直接送公司测序
四、16SrDNA与T载体酶连
连接体系
T载体连接液(购买)(含TDNA连接酶):5ul4
16SrDNA:4ul
HO:
):(购买
上述溶液加入PCR管,在PCR仪中于16?(or15?)连接4,12小时
五、16SrDNA转化感受态细胞
-70?(200ul),于冰盒或冰浴上
融化,立即转至冰浴,放置10min。
(10ul)加入到装有200ul感受态细
胞的管中,体积不应超过感受态细胞的5%,轻轻旋转几次混匀内容物,冰浴
30min(轻轻混匀,使充分接触,可提高转化效率)。
?水浴中,放置90s,不要摇动。
,使细胞冷却1,2min。
,用水浴将培养基加温至37?,然后将管转移至设置
为37?的摇床上,温浴45min,转速应小于225r/min.(常用100rpm)。(200ul)已转化的感受态细胞转移到相应抗生素的LB培养基平板
上(Amp终浓度为100mg/L,X-gal终浓度为100mg/L)。
-3个平板,剩余的已转化感受态细胞放4中保存,不成功可第二天再涂平
板。
,提取质粒DNA,
利用质粒多克隆位点内的插入外源DNA片段侧翼的酶切位点用相应的限制
性内切酶进行酶切鉴定,也可以直接用菌落PCR进行鉴定。,通过琼脂糖凝胶电泳鉴定克隆DNAUCKUCK
片段的大小。
。
六、试剂配制
1、50×TAE(L)
242gTris

-Na(PH:)2
2、-Na2(PH:)
-Na,加70ml重蒸水,加7ml,加10mol/LNaOH,加热搅拌溶解后,2
再用10mol/,加重蒸水至100ml,高压灭菌备用。
3、引物稀释
配成25uM引物需加ddHO量为X2
×10/X(ddHO)=25pmol/ul2
3X(ulddHO)=×10pmol/25pmol/ul2
注:1OD=