16SrDNA鉴定细菌的方法.doc

16S rDNA鉴定细菌的方法
细菌16S rDNA鉴定主要分为7个部分:
,
,电泳检测纯度与大小。


。
。

试剂:
:通常选择组分简单且细菌生长良好的培养基(培养基组分过于复杂会影响DNA的提取效果,也可以在裂解细菌前用TE缓冲液对菌体进行洗涤。)。
1M Tris-HCl (, , )(1L): Tris,加浓盐酸约(70ml, 60ml, 42ml),高温高盐灭菌后,室温保存。冷却到室温后调pH,每升高1℃,。
EDTA()(1L): Na2EDTA•2H2O,(约20g),高温高压灭菌,室温保存。
10×TE Buffer(,,)(1L):组分:100 mM Tris-HCl,10 mM EDTA。1M Tris-HCl(,,)取100ml, EDTA()取20ml。高温高压灭菌,室温保存。
1×TE Buffer用10×TE Buffer稀释10倍即可。
10%SDS(W/V):称10g,68℃加热溶解,。室温保存。用之前在65℃溶解。配置时要戴口罩。
6、5M NaCl:,高温高压灭菌,4℃保存。
7、CTAB/NaCl(10%CTAB, NaCl): NaCl,加10g CTAB(十六烷基三甲基溴化铵),加热搅拌。用之前在65℃溶解。
8、氯仿/异戊醇:按氯仿:异戊醇=24:1(V/V)的比例加入异戊醇。
9、酚/氯仿/异戊醇(25:24:1):按苯酚与氯仿/异戊醇=1:1的比例混合Tris-HCl平衡苯酚与氯仿/异戊醇。
10、TAE缓冲液:使用液1×: mol/L Tris-乙酸, mol/L EDTA。浓储存液50×:242g Tris, ml 冰醋酸,100 ml mol/L EDTA ()。
11、6×上样缓冲液(100 ml):%溴酚蓝(BPB),40%蔗糖,10 mmol/L EDTA ()( ml),4℃保存。
12、%琼脂糖凝胶: ml。
13、EB:10 mg/ml。称取1g溴化乙锭定容至100ml。棕色瓶室温避光保存。。当配置50ml 。(因EB是剧毒物质,目前很多实验室用生物荧光染料替代,常用的有Gelred等)
14、蛋白酶K:20 mg/ml 溶于水,-20℃保存,反应浓度50 ug/ml,反应缓冲液: mol/L Tris (pH ), mol/L EDTA, 5% SDS,反应温度37-56℃。无需预处理。
15、RNase A:10 mg/ml。25 mg RNase A 加1M Tris(pH )25ul, NaCl 15ul,无菌水2460 ul,于100
℃加热15分钟,缓慢冷却至室温,分装成小份保存于-20℃。(为避免RNA的干扰,使用RNA酶降解基因组中的RNA。)

基本步骤:
材料准备

破碎细胞或胞膜—内容物释放
核算分离、纯化
沉淀或吸附核酸,并去除杂质
核酸溶解在适量缓冲液或水中
基因组DNA提取所需仪器:高速冷冻离心机、恒温冰箱、移液器、水平电泳槽、紫外/荧光观测仪
细菌基因组DNA提取方法综述
细菌基因组DNA的提取方法主要有5种。不同的方法所选择的试剂会有所不同。
1 快速微量提取法
,12000rpm离心1min, 丢去上清夜,收集菌体。
加入400ul裂解液(40mMTris-醋酸,20mM醋酸钠,1mMEDTA,1%SDS,)混匀,置于37oC水浴1hr。
然后加入200ul5mol/L的氯化钠溶液,混匀后于13000rpm离心15min。
取上清液,用苯酚抽提2次,氯仿抽提1次。
加两倍体积无水乙醇,1/10体积醋酸钾(3M ,),-20度保存1小时后,13000rpm离心15min,弃上清液,沉淀用70%乙醇洗2次;置于室温干燥后,溶于50ulTE溶液中,置4℃保存备用。
2 蛋白酶/SDS法制备
用1