实验二蔗糖酶.ppt

生物技术综合实验

实验二、酵母蔗糖酶的提取和酶活测定
实验目的
学习提取酵母蔗糖酶和测定酶活力的方法;
学习提取生物活性大分子的方法。
实验材料
材料:活性干酵母粉、石英砂;
试剂:95%冰乙醇、DNS液、PBS()、
5%蔗糖溶液、1N NaOH溶液;
仪器:水浴锅、高速冷冻离心机、722型分光
光度计。
实验原理
蔗糖酶的提取过程和酶活的测定方法;
蛋白质等生物活性大分子的提取方法。
提取工艺和酶活测定
蔗糖酶
蔗糖酶的耐热温度为50度,45度以下可保持酶活不变;~;
蔗糖酶的活性中心有巯基,因此在提取时应防止其被氧化,或者加入还原剂(如Vc)保持酶活力;
酵母细胞存在两种蔗糖酶,一种在细胞壁中,一种在细胞质内,前者活力较高,分子量较大(约270KDa),后者活力较低,分子量约为135KDa,两种酶的底物专一性和动力学性质十分相似,因此,本实验未区分内酶与外酶。
提取工艺
1. 破碎酵母细胞的方法:
蔗糖酶分子量较大,一般采用研磨法彻底破碎细胞使其释放出来,但应注意研磨过程中保持低温防止酶失活;
或者采用自溶法(适当的酸度和温度下利用酵母菌自身的酶系破坏细胞壁),此方法较为温和,但是时间较长,需加入少量防腐剂,防止过程中外界细菌污染;
原则:低温,处理时间短,防止酶失活。
2. 选择性热变性:
根据蔗糖酶的耐热性质,将热不稳定性杂蛋白变性除去,
而蔗糖酶保持活性仍在上清液中;该法简便易行。
原则:1、选择合适的温度和加热时间,防止目的物变性,
2、溶液的蛋白质浓度要合适,防止蔗糖酶与杂蛋白共沉淀。
3. 有机溶剂沉淀法:
根据蔗糖酶的分子量和亲水性,在溶液中加入一定量的无水乙醇溶
液,利用其脱水作用,破坏了蛋白质分子表面的水化膜,使蔗糖酶
聚集沉淀下来,而与其它杂质分开。一般采用分级沉淀法摸索目的
物沉淀的条件。
原则:1、注意在低温下操作,故无水乙醇要预冷;
2、边加乙醇边搅拌溶液,防止局部乙醇过浓,导致酶变性失活;
3、离心后应迅速将上清倒出,沉淀物用缓冲液溶解,避免酶与有
机溶剂长时间接触,防止其变性。
测定酶活的原理
蔗糖酶可作用于β-1,2糖苷键,将蔗糖水解为D-葡萄糖和D-果糖; Cu2+ 、 Zn2+ 、 Fe2+ 是其激活剂,Mn2+ 是其抑制剂。
葡萄糖和果糖具有还原性,在偏碱性条件下,可与3,5-二硝基水杨酸共热后生成棕红色物质,在一定浓度范围内,还原糖的量和反应液的颜色强度成正比例关系。
蔗糖酶的活力通过其水解生成的还原糖量来反映。
提取酶注意事项
了解目的物的分子量、酸碱稳定性、热稳定性,选择合适的提取条件;
提取过程中采用缓冲液系统溶解酶,并可添加一些保护剂(如还原剂、金属螯合剂等);
提取过程一般保持低温、避免剧烈搅拌、强酸、强碱等变性的因素;
一般先选择分辨率低处理量大的方法(如萃取、沉淀、吸附)浓缩酶,再采用分辨率高的方法(如离子交换层析、亲和层析、超滤)精制;
通过酶活测定,调节提取条件。