使用Oligo 6和Primer Premier 5.doc

使用Oligo 6和Primer Premier 5
张新宇
(中国医科院肿瘤研究所,北京100021)
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在当今分子生物学研究中,PCR技术已成为使用最多,最广泛的技术之一。而引物设计是PCR技术中至关重要的一环。在PCR扩增以前,一般模板序列已被全部或部分确定。要想扩增出理想的目的片断,一般都得通过正确设计PCR引物。也有的人不经过设计直接取模板序列的两个片断作为引物,这样很可能导致实验失败,如扩增出多条带(引发错配所致),不出目的带或出目的带很弱(引物引发效率低下),引物二聚体带(引物与引物之间形成稳定二聚体)等等。
现在PCR引物设计都通过计算机软件进行。生物信息学发展至今日,具有引物设计功能的软件有很多,其中大部分是免费软件,可直接从网上下载,安装并运行。这类软件大都简单易用,但其引物设计功能一般不很强,通过它们设计的引物常常不尽如人意,而专门进行引物设计的商业版软件功能强大,但使用起来不太容易。本文就这一问题进行探讨。
引物设计的原则
引物设计有几条基本原则:
首先引物要跟模板紧密结合,其次引物与引物之间不能有稳定的二聚体或发夹结构存在,再次引物不能在别的非目的位点引起DNA聚合反应
(即错配)。
围绕这几条基本原则,设计引物需要考虑诸多因素,如引物长度(primer length),产物长度(product length),序列Tm值(melting temperature),ΔG值(internal stability),引物二聚体及发夹结构(duplex formation and hairpin),错误引发位点(false priming site),position),有时还要对引物进行修饰,如增加限制酶切点,引进突变等。以使用Oligo软件分析设计引物为例,笔者总结出以下的要点:
1. 引物的长度一般为15-30bp,常用的是18-27bp,但不能大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74℃,即Taq酶的最适温度。
2. 引物3’端的序列要比5’端重要。引物3’端的碱基一般不用A,因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高。另外引物间3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5’端序列对PCR影响不大,因此常用来引进修饰位点或标记物。
3. 引物的GC含量一般为40-60%,过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。
4. 引物所对应模板序列的Tm值最好在72℃左右。
5. ΔG值(自由能)反映了引物与模板结合的强弱程度。一般情况下,引物的ΔG值最好呈正弦曲线形状,即5’端和中间ΔG值较高,而3’端ΔG值相对较低,且不要超过9(ΔG值为负值,这里取绝对值),如此则有利于正确引发反应而可防止错误引发。
6. 可能的错误引发位点决定于引物序列组成与模板序列组成的相似性,相似性高则错误引发率高,错误引发的引发率一般不要高过
100,如此可保证不出非目的产物的假带。
7. ,否则容易产生引物二聚体带而且会降 1
低引物浓度从而导致PCR正常反应不能进行,与二聚体相关的一个参数是碱基的分布,3’会导致错误引发。
8. 对引物的修饰一般