PI染色.pdf

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荧光染料PI(碘化丙啶)是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂,常用于细胞
凋亡检测,英文全称是PropidiumIodide。它是一种溴化乙啶的类似物,在嵌
入双链DNA后释放红色荧光。尽管PI不能通过活细胞膜,但却能穿过破损的细
胞膜而对核染色。PI经常被用来与Calcein-AM或者FDA等荧光探针一起使用,
能同时对活细胞和死细胞染色。PI-DNA复合物的激发和发射波长分别为535nm
和615nm。
PI可以用来进行活细胞、死细胞的双重染色
钙黄绿素-AM(Calcein-AM)和碘化丙啶(PI)溶液,它们分别可对活细胞和死细胞
染色。Calcein-AM的乙酸甲基酯亲脂性很高,使其可透过细胞膜。尽管Calcein
-AM本身并不是荧光分子,但通过活细胞内的酯酶作用,Calcein-AM能脱去AM
基,产生的Calcein能发出强绿色荧光(激发:490nm,发射:515nm)。因此
Calcein-AM仅对活细胞染色。另一方面,作为核染色染料的PI不能穿过活细
胞的细胞膜。它穿过死细胞膜的无序区域而到达细胞核,并嵌入细胞的DNA双螺
旋从而产生红色荧光(激发:535nm,发射:617nm)。由于Calcein和PI-DNA
都可被490nm激发,因此可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞。用545nm
激发,可仅观察到死细胞。由于不同细胞系的最佳染色条件不同,我们建议个别
确定PI和Calcein-AM的合适浓度。

Calcein-AM
PI

以HeLa细胞染色为例,请注意不同的细胞种类、不同浓度有不同的观察条件。
根据细胞条件,摸索不同条件下的细胞贴壁情况和试剂浓度的配制等最佳条件。

1)用1ml无水DMSO溶解1mgCalcein-AM,制备成1mmol/l的Calcein-AM储
备液,-20℃下密闭冷冻保存。
2)用1mlddHO溶解1mgPI,(1mgPI/1ml
2
HO),-20℃下密闭冷冻保存。
2
3)将Calcein-AM储备液和PI储备液放置于室温。
4)加10μlCalcein-AM储备液和15μlPI储备液至5mlPBS中配制成染色
溶液。
Calcein-AM的终浓度为2μmol/l,PI的终浓度为4μmol/l。

1)染色HeLa细胞等贴壁细胞时,先用Trypsin-EDTA等消化细胞,制备成细胞悬
液。
2)将细胞悬液离心3分钟(1,000rpm)。
3)去除上清液,加入PBS缓冲液,细胞数量调整至105–106个/ml。再用移液
器充分混匀。
4)由于培养基中的血清等含有酯酶,Calcein-AM遇水会分解,会导致空白上升,
所以需要离心数次,用PBS洗涤数次直到完全洗净。
5)将200μl细胞悬液移至小试管中,加入100μl染色溶液,在37℃下孵育15
分钟。
6)在盖玻片上滴加适量的染色的细胞溶液。
7)在荧光显微镜下,先使用490±10nm波长激发,观察黄绿色的活细胞,还可
以同时观察到红色的死细胞,然后用545nm波长激发,能够看到红色的死细胞。
*在荧光显微镜下观察时,如果背景高,可以用培养基清洗掉细胞外的染料后再
观察。
*Calcein-AM溶液和PI溶液可以混合在一起染色,也可以分开进行染色,加入
的先后顺序没有影响。
7)在荧光显微镜下,先使用490±10nm波长激发,观察黄绿色的活细胞,还可
以同时观察到红色的死细胞,然后用545nm波长激发,能够看到红色的死细胞。
*在荧光显微镜下观察时,如果背景高,可以用培养基清洗掉细胞外的染料后再
观察。
*Calcein-AM溶液和PI溶液可以混合在一起染色,也可以分开进行染色,加入
的先后顺序没有影响。

Calcein-AM和PI的最适浓度是根据不同的细胞种类而定,通过以下的操作,我
们可以找到不同细胞染色试剂的最佳浓。度
1)%-%毛地黄皂苷中孵育10分钟或通过在70%乙醇中孵育
30分钟制备死细胞。
2)-10μM的PI溶液对死细胞染色,以便找到仅对细胞核染色而不对细
胞质染色的PI浓。度
3)-10μM的Calcein-AM溶液对死细胞染色,以便找到不对细胞质染色
的Calcein-AM浓。度接着用该浓的度Calcein-AM对活细胞染色以检验活细胞
可否被染色。

1)Calcein-AM的ester部位遇到湿气会分解,使用后请在-20℃下密闭冷冻保
存,防止水分进入。Calcein-AM储备液用缓冲液或培养基等稀释时尽量现配现
用。
2)PI溶液在冷冻的条件下可以保存一年。PI有引致癌的可能性,请在使用时注
意以下3点。
·使用时一定要带手套、眼罩、口罩。
·万一接触到皮肤的话,迅速使用大量水清洗。
·处理方法
使用器具的洗涤液等废液请按照不同的处理方法来处理,或者按照如下的处理方
法,分解后再丢弃。用UV照射或光照分解。用次氯酸钠氧化分解后,做中和处
理。
染色例: