土壤脲酶、蔗糖酶、磷酸酶活性的测定.doc

土壤脲酶、蔗糖酶、磷酸酶活性的测定
土壤酶活性的测定
方法及部分样品配制详细请参考《土壤微生物分析方法手册》,《土壤酶及其研究法》土壤样品采集与制备
土壤样品取样后混匀,用于土壤酶活性测定的土壤磨细过2mm筛后,置于4℃冰箱内保存备测。
1. 土壤酶活性的测定方法
. 脲酶采用靛酚蓝比色法
方法原理:本法基于以尿素为基质,酶促水解生成的氨与酚类化合物起反应生成蓝色的靛酚,颜色深度与氨含量相关,用于尿酶活性的测定。
操作步骤:取10g风干土,置于100ml三角瓶中,加2ml甲苯,15min后加10ml 10%尿素液和20ml 。摇匀后在37℃恒温箱中培养3h。按此操作,进行以水代替基质,及无土壤的基质对照测定,,然后按绘制标准曲线显色方法进行比色测定。
氮的标液:精确称取 1000ml,。绘制标准曲线时,可将此液稀释10倍供用。
:用368g柠檬酸溶于600ml水,另取295g氢氧化钾溶于水,再将二种溶液混合,,定容到2L。苯酚溶液:称取苯酚(C6H5OH)10g和硝基铁氰化钠
[)5NO2H2O]100mg稀释至1L。此试剂不稳定,须贮于棕色瓶中,在4℃冰箱中保存。
次氯酸钠碱性溶液:称取氢氧化钠(化学纯)10g、磷酸氢二钠(Na2HPO4·7H2O, 化学纯)、磷酸钠(Na3PO4·12H2O, 化学纯) ·L-1次氯酸钠(NaOCl,化学纯,即含5%有效氯的漂白粉溶液)10mL溶于水中,稀释至1L,贮于棕色瓶中,在4℃冰箱中保存。
标线绘制:取稀释的标准液0、l、2、4、6、8、10ml,移于50rnl容量瓶中,然后加入蒸馏水至20mL。再加4mL苯酸钠溶液和4mL次氯酸钠溶液,随加随摇匀。30min后显色,定容。在分光光度计上于578nm处比色。根据光密度值与溶液浓度绘制标线。
. 蔗糖酶采用磷钼酸比色法
方法原理:本法基于蔗糖酶酶解所得还原糖具有的还原性,能使磷钼酸络合物生成蓝色化合物,颜色强度与还原糖量相关,因而用比色测定还原糖量用于表示酶的活性。
操作步骤:称5g土,置于100ml三角瓶中,加入10ml 水,1ml甲苯。摇匀使土壤均有分散后,放置15分钟,加入15毫升5%蔗糖-磷酸缓冲液,摇匀混合物后,放入恒温箱,在37℃下培养24h。按此操作,用不加土壤的基质和150摄氏度干热灭菌1小时的土壤进行对照试验,,按标准曲线步骤显色测定,
:1/15M磷酸氢二钠( Na2PO4?2H2O溶于1L蒸馏水中) 磷酸二氢钾()
。
钼酸铵溶液:a)5%钼酸铵溶液;b)200ml浓硫酸加入800ml水,使用前按1:1将a与b混合
5%蔗糖溶液()
铜试剂:a)50gCuSO4·5H2O溶于500ml水;b)25gNa2CO3。25g酒石酸钾钠,20g NaHCO3和200gNa