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多克隆抗体的制备方法1
抗体的制备方法与原理
一、抗血清的制备
有了质量好的抗原,还必须选择适当的免疫途径,才能产生质量好(特异性强和效价高)的抗体。
(一)用于免疫的动物
作免疫用的动物有哺乳类和禽类,主要为羊、马、家兔、猴、猪、豚鼠、鸡等,实验室常用者为家兔、山羊和豚鼠等。动物种类的选择主要根据抗原的生物学特性和所要获得抗血清数量,如一般制备抗r-免疫球蛋白抗血清,多用家兔和山羊,因动物反应良好,而且能够提供足够数量的血清,用于免疫的动物应适龄,健壮,无感染性疾患,最好为///雄性,此外还需十分注意动物的饲养,以消除动物的个体差异以及在免疫过程中死亡的影响。若用兔,最好用纯种新西兰兔,一组三只,兔的体重以2~3kg为宜。
(二)免疫途径
免疫途径有多种多样,如静脉内、腹腔内、肌肉内、皮内、皮下、淋巴结内注射等,一般常用皮下或背部多点皮内注射,。途径的选择决定于抗原的生物学特性和理化特性,如激素、酶、毒素等生物学活性抗原,一般不宜采用静脉注射。
(三)佐剂
由于不同个体对同一抗原的反应性不同,而且不同抗原产生免疫反应
的能力也有强有弱,因此常常在注射抗原的同时,加入能增强抗原的抗原性物质,以刺激机体产生较强的免疫反应,这种物质称为免疫佐剂。佐剂除了延长抗原在体内的存留时间,增加抗原刺激作用外,更主要的是,它能刺激网状内皮系统,使参与免疫反应的免疫活性细胞增多,促进T细胞与B细胞的相互作用,从而增强机体对抗原的细胞免疫和抗体的产生。
常用的佐剂是福氏佐剂(Freund adjuvant),其成分通常是羊毛脂1份、石腊油5份,羊毛脂与石腊油的比例,视需要可调整为1:2~9(V/V),这是不完全福氏佐剂,在每毫升不完全佐剂加入1~20mg卡介苗就成为完全佐剂。
配制方法:按比例将羊毛脂与石蜡油置容器内,用超声波使之混匀,高压灭菌,置4℃下保存备用。免疫前取等容积完全或不完全佐剂与免疫原溶液混合,用振荡器混匀成乳状,也可以在免疫前取需要量佐剂置乳钵中研磨,均匀后再边磨边滴加入等容积抗原液(其中加卡介苗3~4mg/ml或不加),加完后再继续研磨成乳剂,滴于冰水上5~10min内完全不扩散为止。为避免损失抗原,亦可用一注射器装抗原液,另一注射器装佐剂,二者以聚乙烯塑料管连接,然后二者来回反复抽吸,约数十分钟后即能完全乳化。检查合格后即以其中一注射器作注射用。
免疫佐剂
免疫佐剂(immunoadjuvant)
又称非特异性免疫增生剂。本身不具抗原性,但同抗原一起或预先注射到机体内能增强免疫原性(见抗原)或改变免疫反应类型。种类很多,目前尚无统一的分类方法,常用的佐剂可分为
4类:无机佐剂,如氢氧化铝,明矾等;有机佐剂,微生物及其产物如分枝杆菌(结核杆菌、卡介苗)、短小杆菌、百日咳杆菌、内毒素、细菌提取物(胞壁酰二肽)等;合成佐剂,如人工合成的双链多聚核苷酸(双链多聚腺苷酸、尿苷酸)、左旋咪唑、异丙肌苷等;油剂,如费氏佐剂、花生油乳化佐剂、矿物油、植物油等。弗氏佐剂目前在实验动物中最常用,又可分为弗氏不完全佐剂和完全佐剂两种。不完全佐剂是油剂(石蜡油或植物油)与乳化剂(羊毛脂或吐温(Tween)80)相混合而成,当其再与抗原混合,即成油包水乳剂,可用于免疫注射。
在不完全佐剂中加入死的分枝杆菌,即成为弗氏完全佐剂。完全佐剂的免疫强度大于不完全佐剂。该佐剂主要用于动物实验,不适宜于人类使用。而且动物多次注射后也常会发生佐剂病。
免疫佐剂的生物作用包括:
(1)抗原物质混合佐剂注入机体后,改变了抗原的物理性状,可使抗原物质缓慢地释放,延长了抗原的作用时间;
(2)佐剂吸附了抗原后,增加了抗原的表面积,使抗原易于被巨噬细胞吞噬;
(3)佐剂能刺激吞噬细胞对抗原的处理;
(4)佐剂可促进淋巴细胞之间的接触,增强辅助T细胞的作用;
(5)可刺激致敏淋巴细胞的分裂和浆细胞产生抗体。故免疫佐剂的作用可使无免疫原性物质变成有效的免疫原;
(6)可提高机体初次和再次免疫应答的抗体滴变;
(7)改变抗体的产生类型以及产生迟发型变态反应,并使其增强。
具备条件
佐剂的条件作为一种良好的佐剂,必须具备下列条件:
(1) 增加抗原的表面积,并改变抗原的活性基团构型,从而增强抗原的免疫原性;
(2) 佐剂与抗原混合能延长抗原在局部组织的存留时间,减低抗原的分解速度,使抗原缓慢释放至淋巴系统中,持续刺激机体产生高滴度的抗体;
(3) 佐剂可以直接或间接激活免疫活性细胞并使之增生,从而增强了体液免疫、细胞免疫和非特异性免疫功能;
(4) 良好的佐剂应具有无毒性或副作用低的特点。
常用佐剂的种类和制备
佐剂主要可分为两种:一