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基于dns分析实现柚苷酶催化柚皮苷的快速优化方法
本发明公开了一种基于DNS分析实现柚苷酶催化柚皮苷的快速优化方法,所述方法包括培养基的制备、固态发酵、粗酶液的制备、酶催化反应、DNS法分析还原糖生成量等步骤,所述DNS法是采用2,4-二硝基水杨酸即DNS分析所述酶催化反应的还原糖生成量,,摇匀,100°C水浴15min,随即取出用自来水冷却,再用蒸馏水定容至5mL,于520nm波长下测定吸光值,依据标准曲线来计算反应液中还原糖的生成量。本方法可实现快速优化柚苷酶催化柚皮苷的目的,并进一步优化了催化条件,在此条件下,柚皮苷的转化率得到了很大的提高。
【专利说明】基于DNS分析实现柚苷酶催化柚皮苷的快速优化方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物催化的【技术领域】,尤其涉及一种基于DNS分析实现柚苷酶催化柚皮苷的快速优化方法。
【背景技术】
[0002]柚皮苷(4,5,7-trihydroxyflavanone-7-β-L-rhamnoglucoside-(I,2)-a-D-glucopyranoside)是一种二氢黄酮糖苷类化合物,它是芸香科植物,如葡萄柚、蜜柚、酸橙等的主要苦味物质,具有抗溃疡、消炎、抗氧化及抑菌等一系列的生物活性,在食品、药品及化妆品等领域具有很好的应用前景。然而,柚皮苷在常温下的溶解性较差,以致其在工业上的应用受到了较大程度的限制,为改善其水溶性或脂溶性,或提高其生理活性、增加新的功能等,进而提高其生物利用度,目前国内外主要采用化学法和酶法对柚皮苷进行改性研究,相比于化学改性法,酶法改性柚皮苷具有选择性强,反应条件温和,产物易分离及对环境危害小等优点,因而具有更好的研究意义和价值。
[0003]柚苷酶是由a-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶组成的复合酶,它催化柚皮苷的水解反应主要有两个过程:首先,柚皮苷在a-L-鼠李糖苷酶的作用下分解成鼠李糖和普鲁宁,其次,普鲁宁又在β-D-葡萄糖苷酶的作用下分解成葡萄糖和柚皮素。
[0004]在现有技术中,通常采用高效液相色谱法检测柚皮苷的减少量或柚皮素的生成量,来分析柚皮苷的水解过程。,名称为《一种胃肠安丸中柚皮苷含量的测定方法》,名称为《接骨续筋制剂中的柚皮苷含量测定方法》两篇专利文献中,均是通过高效液相色谱法的方法来测定柚皮苷的含量,虽然,此方法准确度高,但是这种方法较为繁琐耗时,对于柚皮苷的大规模测定,例如,在发酵条件优化时,需要消耗大量的人力物力。
[0005]鉴于柚苷酶催化柚皮苷生成柚皮素的过程同时也是还原糖生成的过程,且在此过程中还原糖的生成应与柚皮苷的水解和柚皮素的生成具有相关性。因此,本发明人研究和设计了一种基于DNS分析实现柚苷酶催化柚皮苷的快速优化方法,本案由此产生。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种基于DNS分析实现柚苷酶催化柚皮苷的快速优化方法,通过DNS分析柚苷酶催化柚皮苷反应过程中产生的鼠李糖还原糖及葡萄糖还原糖的含量,达到快速优化柚苷酶催化柚皮苷的目的,并进一步分析了不同工艺参数对柚皮苷转化过程的影响,进而为利用柚苷酶改性柚皮苷获得特定生物活性的改性产物提供了研究基础。
[0007]为了实现上述目的,本发明所采用的技术方案如下:
一种基于DNS分析实现柚苷酶催化柚皮苷的快速优化方法,本方法包括以下步骤:步骤一、培养基的制备:所述培养基的制备包括斜面培养基的制备及固态培养基的制备,其中:所述斜面培养基的制备,按以下质量体积浓度的组分制备=,,(MM),,,,,,琼脂20g/L,,1X105Pa灭菌20min;所述固态培养基的制备,按以下重量的组分制备:柚皮粉160g,豆饼粉24g,麸皮1%,KNO31%
,固水比为1:,IXlO5Pa灭菌20min;
步骤二、固态发酵:将棘孢曲霉菌种接种于所述斜面培养基上,28°C培养3-4d,使所述斜面培养基上长满孢子,用无菌生理盐水洗下孢子,,将ImL单孢子菌悬液接入装有所述固态培养基的250mL的三角瓶中,每瓶装样量为5g,于28°C下培养7-8d;步骤三、粗酶液的制备:以1:20的固液比,用磷酸盐缓冲液对固态发酵物进行浸泡Ih,搅匀后抽滤并收集滤液,将所述滤液于4°C以12000Xg离心10min,收集上清液即得粗酶液,于0-4°C下保藏备用;
步骤四、酶催化反应:所述酶催化反应为游离柚皮苷的酶催化反应和/或固定化柚皮苷的酶催化反应,其中,所述游离柚皮苷的酶催化反应为:在50mL的反应体系中,-,酶用量为4-12U/mL,-醋酸钠溶液为缓冲液,-,置于恒温振荡水槽中,反应温度为30-70°C,振荡反应4h,振速为0-160次/min,从加入酶液开始计时,每30min取反应液一次,沸水灭活后,冷却至室温;所述固定化柚皮苷的酶催化反应为:在50mL的反应体系中,加入Ig湿重的树脂,-,酶用量为4-12U/mL,-醋酸钠溶液为缓冲液,-,置于恒温振荡水槽中,反应温度为30-70°C
,振荡反应4h,振速为0-160次/min,期间从加入酶液开始计时,每隔一段时间取反应液一次,并立即用沸水浴灭活20min,冷却至室温;在其他条件不变的情况下,分别对所述的柚皮苷浓度、酶用量、反应PH值、反应温度及振速进行单因素试验,以确定最佳反应条件;
步骤五、DNS法分析还原糖生成量:采用2,4-二硝基水杨酸即DNS分析所述酶催化反应的还原糖生成量:,摇匀,100°C水浴15min,随即取出用自来水冷却,再用蒸懼水定容至5mL,于520nm波长下测定吸光值,依据标准曲线来计算反应液中还原糖的生成量,其中,绘制标准曲线时,以等摩尔比的鼠李糖和葡萄糖组成的混合溶液为标准溶液,其浓度为0-2mg/mL。
[0008]作为实施例的优选方式,所述步骤四中,所述游离柚皮苷的酶催化反应中,,酶用量为8U/mL,,反应温度为50°C,酶解反应120min。
[0009]作为实施例的优选方式,所述步骤四中,所述固定化柚皮苷的酶催化反应中,,酶用量为8U/mL,,反应温度为50°C,振速为80次/min,酶解反应6h。
[0010]作为实施例的优选方式,所述方法还包括酶解产物的分离纯化步骤,即在酶催化反应结束后,立即沸水浴灭活
20min,冷却至室温,过滤收集树脂,装柱后,先用蒸馏水以ImL/min的流速进行清洗,然后用一定体积浓度的乙醇进行洗脱,用分步收集器分段收集洗脱液,同时采用薄层色谱法对洗脱液中的成分进行跟踪检测定性,将成分相同,即斑点相同的洗脱液进行合并,并将洗脱液进行减压蒸馏浓缩得浓缩物,同时回收乙醇,然后再将浓缩物用甲醇重结晶,得酶解产物纯品,即柚皮素纯品。
[0011]作为实施例的优选方式,所述方法还包括酶解产物的定性分析步骤,即在收集所述柚皮素纯品后,称取所述柚皮素纯品及柚皮素标准品,用甲醇溶解并定容后,分别采用紫外分光光度、红外光谱和高效液相色谱HPLC法对所述柚皮素纯品进行定性分析和纯度测定。
[0012]作为实施例的优选方式,所述方法还包括柚苷酶活力的测定步骤,即在收集所述粗酶液后,,,,于50°C水浴中预热5min,再加入2mL,300mg/L柚皮苷标准液,50°C,反应5min后,于100°C水浴加热20min使酶失活,取出后迅速冷却至室温,,12000Xg离心15min,HPLC待测,对照组为先将粗酶液灭活后再加入柚皮苷标准液,其他操作相同;以在50°C、,每分钟生成Iμg柚皮素所需的酶量定义为一个柚苷酶活力单位。
[0013]作为实施例的优选方式,所述最佳反应条件是以柚皮苷的最大转化率得出的,计算柚皮苷转化率的方法为:其中,HPLC法:柚皮苷转化率(%)=柚皮苷的催化量(mg)X100/酶催化反应前柚皮苷的总量(mg);DNS法:柚皮苷转化率(%)=酶催化反应中还原糖的生成量(mg)X100/柚皮苷被完全催化时还原糖的生成量(mg)。
[0014]采用上述方法后,本发明通过通过DNS分析柚苷酶催化柚皮苷反应过程中产生的鼠李糖还原糖及葡萄糖还原糖的含量,达到快速优化柚苷酶催化柚皮苷的目的,并进一步分析了不同工艺参数对柚皮苷转化过程的影响,确定了最佳优化条件,所得的柚皮苷转化率高,其中,%,%,进而为利用柚苷酶改性柚皮苷获得特定生物活性的改性产物提供了研究基础。
[0015]【专利附图】
【附图说明】
图1为本发明HPLC法和DNS法测得的柚皮苷转化率的关系;`图2为本发明柚苷酶催化游离柚皮苷过程优化中,酶用量对柚皮苷酶解作用的优化;图3为本发明柚苷酶催化游离柚皮苷过程优化中,底物浓度对柚皮苷酶解作用的优
化;
图4为本发明柚苷酶催化游离柚皮苷过程优化中,pH值对柚皮苷酶解作用的优化;
图5为本发明柚苷酶催化游离柚皮苷过程优化中,温度对柚皮苷酶解作用的优化;
图6为本发明柚苷酶催化游离柚皮苷过程优化中,振荡速率对柚皮苷酶解的优化;
图7为本发明固定化柚皮苷的酶解过程优化中,酶用量对柚皮苷酶解作用的优化;
图8为本发明固定化柚皮苷的酶解过程优化中,底物浓度对柚皮苷酶解作用的优化;图9为本发明固定化柚皮苷的酶解过程优化中,pH值对柚皮苷酶解作用的优化;
图10为本发明固定化柚皮苷的酶解过程优化中,温度对柚皮苷酶解作用的优化;
图11为本发明固定化柚皮苷的酶解过程优化中,振荡速率对柚皮苷酶解作用的优化。
【具体实施方式】
[0016]本发明首先采用高效液相色谱法和DNS法对柚皮苷酶解过程中柚皮苷、普鲁宁、柚皮素和还原糖含量的变化关系进行了分析,并在此基础上探索了仅用DNS法分析柚皮苷酶解过程的可行性,继而利用该方法,分析了不同工艺参数对柚皮苷转化过程的影响,为利用柚苷酶改性柚皮苷获得特定生物活性的改性产物提供研究基础。
[0017]实施例一材料与方法一种基于DNS分析实现柚苷酶催化柚皮苷的快速优化方法,本方法包括以下步骤:步骤一、培养基的制备:所述培养基的制备包括斜面培养基的制备及固态培养基的制备,其中:所述斜面培养基的制备,按以下质量体积浓度的组分制备=,,(MM),,,,,,琼脂20g/L,,1X105Pa灭菌20min;所述固态培养基的制备,按以下重量的组分制备:柚皮粉160g,豆饼粉24g,麸皮1%,KNO31%,固水比为1:,IXlO5Pa灭菌20min;
步骤二、固态发酵:将棘孢曲霉菌种接种于所述斜面培养基上,28°C培养3-4d,使所述斜面培养基上长满孢子,用无菌生理盐水洗下孢子,,将ImL单孢子菌悬液接入装有所述固态培养基的250mL的三角瓶中,每瓶装样量为5g,于28°C下培养7-8d;
步骤三、粗酶液的制备:以1:20的固液比,用磷酸盐缓冲液对固态发酵物进行浸泡Ih,搅匀后抽滤并收集滤液,将所述滤液于4°C以12000Xg离心10min,收集上清液即得粗酶液,于0-4°C下保藏备用;
步骤四、酶催化反应:所述酶催化反应为游离柚皮苷的酶催化反应和
/或固定化柚皮苷的酶催化反应,其中,所述游离柚皮苷的酶催化反应为:在50mL的反应体系中,-,酶用量为4-12U/mL,-醋酸钠溶液为缓冲液,-,置于恒温振荡水槽中,反应温度为30-70°C,振荡反应4h,振速为0-160次/min,从加入酶液开始计时,每30min取反应液一次,沸水灭活后,冷却至室温;所述固定化柚皮苷的酶催化反应为:在50mL的反应体系中,加入Ig湿重的树脂,-,酶用量为4-12U/mL,-醋酸钠溶液为缓冲液,-,置于恒温振荡水槽中,反应温度为30-70°C,振荡反应4h,振速为0-160次/min,期间从加入酶液开始计时,每隔一段时间取反应液一次,并立即用沸水浴灭活20min,冷却至室温;在其他条件不变的情况下,分别对所述的柚皮苷浓度、酶用量、反应PH值、反应温度及振速进行单因素试验,以确定最佳反应条件;
步骤五、DNS法分析还原糖生成量:采用2,4-二硝基水杨酸即DNS分析所述酶催化反应的还原糖生成量:,摇匀,100°C水浴15min,随即取出用自来水冷却,再用蒸懼水定容至5mL,于520nm波长下测定吸光值,依据标准曲线来计算反应液中还原糖的生成量,其中,绘制标准曲线时,以等摩尔比的鼠李糖和葡萄糖组成的混合溶液为标准溶液,其浓度为