常见问题汇总.doc

常见问题汇总
蛋白&抗体篇
1. WB的泛抗体实验中,为什么总是出现只有一条带的情况?
答:(1)首先要确定这条带的大小;比如,组蛋白H3的信号会很强,经常出现在17kD左右,
如果曝光时间短的话,很可能只存在信号强的条带;
(2)上样量是否足够;
(3)抗体浓度是否正确使用;
(4)荧光底物不灵敏,可调整荧光底物的孵育时间、曝光时间等。
2. WB实验中是否条带越多,蛋白修饰的丰度越高?
答:(1)客户提到的修饰丰度指什么,是一种蛋白的修饰强弱,还是指修饰的广谱性?
(2)同一样品,不同处理的对比,可以这么说;
(3)不同样品,不同来源,无可比性;
(4)条带的强度,可以体现该条带大小的蛋白修饰丰度高。
3. 能否用泛抗体检测单一蛋白/IP复合物的修饰信号?
答:我们公司的蛋白质修饰泛抗体是指可以识别所有含该类修饰的蛋白质的抗体,与组蛋白位点特异性修饰抗体的区别在于不局限于某个蛋白的某个位点。如Lys三甲基化的修饰泛抗体可以识别所有含有Lys三甲基化的蛋白,而组蛋白H3K4Me3就只能特异性的识别组蛋白H3第4位Lys的三甲基化修饰。
因此泛抗体是可以用来检测单一蛋白/IP复合物的修饰信号。
4. 抗体产品用途;如是否可以做ChIP? IP效果如何?
答:(1)抗体可以用来做WB,ELISA,Dot,IP,IF(免疫荧光)等;
(2)我们的泛抗体可以用来做肽段水平的IP且效果非常好,但不建议直接做蛋白水平的IP,效果不是很好,客户用我们的位点特异性抗体尝试做过IP,结论是可以的;
(3) ChIP:我们没有用自己的抗体专门做过相关的检测,但我们也准备对此进行验证。
5. 抗体可以做免疫组化么?
答:免疫组化,是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应,即抗原与抗体特异性结合的原理,通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质),对其进行定位、定性及定量的研究。
我们的抗体是可以做免疫组化、WB、ELISA等实验。
6. 蛋白的提取,特别是枯草芽孢杆菌,发酵菌组蛋白提取的关键?
答:组蛋白提取的方法大同小异,题目中提到的2类菌株我们暂时没有提过。
除了结核杆菌等传染性或致病菌,需要客户经过专业处理后提供蛋白液外,其它样本一般建议客户直接把样品寄来,我们负责蛋白提取。蛋白提取是整个组学项目中最前面、最基础的一步,至关重要,好坏直接影响后续实验结果。因此我们的技术人员经过不断实践总结摸索出的蛋白的提取要点也是公司的技术资源、财富。
7. 我们的泛抗体做WB的比例多少,100微升可以做多少次WB?
答:我们推荐稀释比例都是1:1000,客户可以根据实际情况自行调整。
8. 用乙酰化、琥珀酰化泛抗体做WB检测,客户做不出条带的原因?
答:我们的乙酰化、琥珀酰化泛抗体在生产之后都有专门的质量检测,且在所有抗体销售中是销量较好、客户评价最高的两类的抗体,质量是毋庸置疑的。建议帮助客户从自身WB检测的实验中找原因。
9. 甲基化抗体中单甲基、二甲基、三甲基的抗体如何区分同一位点的一、二、三甲基的基团而互不交叉?
答:(1) 首先,我们在抗体研发过程中,抗原多肽的合成阶段已经区分开;
(2) 其次,景杰生物的所有抗体都经过了严格QC验证,甲基化抗体也不例外。通过Dot Blot和ELISA验证抗体的同一位点不同修饰和相同修饰不同位点之间是否存在交叉。
10. WB显示条带丰度较好,质谱鉴定到的蛋白种类比条带丰度相对不好的蛋白种类要少? 答:WB某一个条带不代表一种蛋白,而是相同分子量的一类蛋白群。因此一个丰度较好的
条带里很可能既存在实际丰度高的蛋白,也存在丰度极低的蛋白,而这些丰度极低的蛋白在质谱中鉴定不到是很正常的。
11. WB没有看出明显变化,为什么还需要做修饰定量分析?
答:(1) 首先要确定客户样品种类,比如酶类,微量变化对生物体本身都会有很大影响;
(2) 同一样品不同处理存在修饰类型变化的可能。
12. 修饰性WB中经常出现低质量处没有条带的原因?
答:(1) 进行SDS-PAGE,看低质量处的蛋白条带丰度如何,确保蛋白的量是足够的;
(2) 胶的压缩分离效果不好,低质量蛋白本身易弥散,且泳动速度快,易跑出分离胶。
13. WB某蛋白有条带,但是MS没检测到该蛋白。为什么?
答:(1) WB是在蛋白水平的检测,MS是基于肽段水平的检测;一般来说免疫水平的检测灵
敏度是高于质谱检测的;
(2)WB某条带为分子量相近的一类蛋白,包含蛋白的丰度不同,有高有低;而质谱一般检测不到过低丰度蛋白;
(3)