肌糖元的酵解作用实验报告.doc

肌糖元的酵解作用
一)目的要求
1、学习鉴定糖酵解作用的原理和方法。
2、了解酵解作用在糖代谢过程中的地位及生理意义。
3、了解有关组织代谢实验应注意的一些问题。
二)实验原理
在动物、植物、微生物等许多生物机体内,糖的无氧分解几乎都按完全相同的过程进行。本实验以动物肌肉组织中肌糖元的酵解过程为例。肌糖元的酵解作用,即肌糖元在缺氧的条件下,经过一系列的酶促反应,最后转变成乳酸的过程。肌肉组织中的肌糖元首先磷酸化,经过己糖磷酸酯、丙糖磷酸酯、甘油磷酸酯、丙酮酸等一系列中间产物,最后生成乳酸。该过程可综合成下列反应式:
(1/n)(C6H10O5)n+H2O 2CH3CHOHCOOH
肌糖元的酵解作用是糖类供给能量的一种方式。当机体突然需要大量的能量,而又供氧不足(如剧烈运动时),则糖元的酵解作用可暂时满足能量消耗的需要。在有氧条件下,组织内糖元的酵解作用受到抑制,而有氧氧化则为糖代谢的主要途径。
糖元酵解作用的实验,一般使用肌肉糜或肌肉提取液。在用肌肉糜时,必须在无氧条件下进行;而用肌肉提取液,则可在有氧条件下进行。因为催化酵解作用的酶系统全部存在于肌肉提取液中,而催化呼吸作用(即三羧酸循环和氧化呼吸链)的酶系统,则集中在线粒体中。
糖元或淀粉的酵解作用,可由乳酸的生成来观测。在除去蛋白质与糖后,乳酸可以与硫酸共热便成乙醛,后者再与对羟基联苯反应生成紫罗兰色物质,根据颜色的显现加以鉴定。
该法比较灵敏,每毫升溶液含1——5ug乳酸即给出明显的颜色反应。若有大量糖类和蛋白质等杂质存在,则严重干扰测定,因此实验中应尽量除尽这些物质。另外,测定时所用的仪器应严格地洗干净。
三)试剂和器材
材料:鸡或兔的肌肉糜
试剂:
1/15mol/L磷酸缓冲液():
对羟基联苯试剂: %NaOH中,%的溶液。若对经基联苯颜色较深,应用丙酮或无水乙醇重结晶,放置时间较长后,会出现针状结晶,应摇匀后使用。
淀粉溶液:%
液体石蜡
CuSO4饱和溶液
Ca(OH)2粉末:
20%三氯乙酸
浓硫酸
3、器材
试管及试管架;移液管:5m1、2m1、1ml、;电子天平;滴管;玻璃棒;恒温水浴;沸水浴; 漏斗;冰浴;滤纸;量筒;旋涡搅拌器
四)操作方法
1、肌肉糜的糖酵解
取4支试管,。1,2号管为样品管,3,4号管为空白管。向3,4号空白管内加入20%三氯乙酸4mL,用玻璃棒将肌肉糜充分打散,搅匀,以沉淀蛋白质和终止酶的反应。%淀粉溶液。3,4管用玻璃棒充分搅匀,加液体石蜡以隔绝空气,并将4支试管同时放入37℃恒温水浴中保温。
1h后,取出试管,立即向1,2号试管内各加入20%三氯乙酸4mL,充分混匀,过滤。然后向每管(一次性试管)内加入饱和硫酸铜溶液1mL,混匀,,充分搅匀2min,放置10min,使还原糖沉淀完全,过滤,保留滤液。
2、乳酸的测定
取4支洁净、干燥试管,编号,各加入浓硫酸2mL,将试管置于冰水浴中冷却,分别取每个样品的滤液2滴,直接加入到已冷却的上述浓硫酸溶液中,随加随摇动试管,避免试管内的溶液局部过热。将每个试管混