2025年SDS-PAGE电泳具体步骤.doc

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一、清洗玻璃板
1、洗洁精轻轻擦洗
2、自来水冲
3、蒸馏水冲
4、筐里晾干
5、梳子用水洗
二、配胶
材料：玻璃板、梳子、架子、枪（100-1000、20-200、2-20）、DDW、30%Arc-Bis、Tris()、Tris()、10%SDS、10%AP、TEMED。
1、玻璃板对齐后放入夹中卡紧
2、配分离胶
3、加入玻璃板中
4、加入乙醇1ml

5、用注射器吸出乙醇，
6、用水冲洗分离胶3次，第4次最终(加入AP、TEMED前)再用注射器吸出
7、配浓缩胶
8、将玻璃板加满
9、放入小梳子

上样
材料：蛋白、marker、针筒、电泳槽、电泳液、枪（2-20ul）
1、把玻璃板取下，放入小架子，固定于电泳槽（大玻璃板朝外），拔梳子，（若只有一块胶，对面用塑料板）
2、将小架子加满电泳液，标识位置，用针筒抽电泳液通膜
3、根据规定上样蛋白（如海马），最外侧加马克，用2-20ul枪
四、电泳
1、放入电泳盒中，盒中加少许电泳液，放上盖子
2、开电泳机
电压先60V，马克抵达分离胶后调制110V，等待约2小时
五、转膜
材料：6张滤纸、1张PVDF膜（根据分离胶剪，无水甲醇中浸泡1min~2min）、转膜夹、转膜缓冲液
1、取胶，将浓缩胶轻轻刮去，去掉多出旳分离胶，
2、将裁好旳胶、浸过甲醇旳PVDF膜和滤纸放入转膜缓冲液中，10min左右，
3、黑色板在下面，纸—胶—膜—纸（注意赶走气泡）
4、转膜夹放入电泳槽，放满转膜缓冲液，外面放冰块，加满水
等待120分钟，电压100V
免疫反应
材料：丽春红、TBST、5%牛奶、一抗、二抗
1、取出一小盒，加入少许丽春红，（用完回收）
2、把膜取出，扔掉胶，依次放丽春红——TBST，（摇床上)
3、膜剪成小条带，放入方格盒，放入TBST（摇床），几分钟后放入5%牛奶中封闭抗原（摇床）
等待1小时
4、配一抗：配5%旳牛奶（5g牛奶，加TBST至100ml），将抗体放入牛奶中。
5、包一抗：将膜放入盛有抗体旳5%旳牛奶中，摇床上1小时
6、4℃冰箱中过夜
7、第2天，取出膜，TBST中洗，10分钟X3次
8、加入二抗，封膜，摇床上，—2h
七、化学发光
准备材料：黄色枪头、20-200ul枪、剪刀、镊子、保鲜膜、板、solution、reagent、小盒中旳膜
1、 取出膜，TBST中洗，10分钟X3次
2、膜放入盒中
3、加solution、reagent至膜上，（A：B=1：1，约60ul）
4、膜放入保鲜膜上包好
5、膜放入板上进屋
6、剪胶片放在膜上下，夹在板里，
等待1小时
7、胶片先放入显影液中
8、胶片先放入定影液中
9、用水冲洗洁净