两种常用纤维素酶活力测定方法---滤纸酶活-CMC酶活.doc

检测纤维素酶酶活力—滤纸酶活力(FPA)
滤纸酶活力代表了纤维素酶的三种酶组分协同作用后的总酶活。
采用3,5一二硝基水杨酸法测定酶活:(简称DNS法)
1、原理:纤维素经纤维素酶水解后生成还原糖,还原糖能将3,5一二硝基水杨酸中硝基还原成氨基,溶液变为橙色的氨基化合物,即:3一氨基一5二硝基水杨酸,在一定的还原糖浓度范围内,橙色的深度与还原糖的浓度成正比,据此可以推算出纤维素酶的活力。
2、采用的滤纸酶活单位定义:
滤纸酶活反映了纤维素酶的3种水解酶,即内切型葡聚糖酶、外切型葡聚糖酶和β葡聚糖苷酶组成的诱导复合酶系的协同水解纤维素能力。是该菌株整个纤维素酶系的酶活力水平的综合体现。代表了纤维素酶的三种酶组分协同作用后的总酶活。在此滤纸酶活单位定义为:以滤纸为底物,在一定反应条件(,50℃,恒温lh)下, 以水解反应中,1ml纤维素酶液1min催化纤维素生成lug葡萄糖为1个滤纸酶活单位,以U表示。
3、滤纸酶活力(FPA)的测定:
,,-乙酸钠缓冲液lml或柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液lml;
再加入50±(1cmx6cm)一条,于50℃保温酶解反应1小时,(先预热5分钟);
加入DNS显色液3ml(),放入已沸腾的水中沸水浴lOmin,流水冷却后在540nm下测吸光度;
同时用100℃煮沸lOmin后失活的酶液做对照,扣除本底;
根据吸光度从葡萄糖标准曲线中查出相应的葡萄糖含量,根据生成的葡萄糖克数计算出酶活值。
滤纸酶活按下面公式计算:
X=(WxNxlOOO)/(TxM)
X:为滤纸酶酶活力,单位U/mL。
W: 为从葡萄糖标准曲线中查得的葡萄糖的浓度。
N: 为酶液稀释总倍数。
T: 为反应时间。
M: 为样品的体积。
4、葡萄糖标准曲线绘制方法
标准曲线绘制:取25ml具塞刻度试管6支, mg /、、、、、,、、、、、, ml,混匀后在沸水浴中加热5分钟,取出立即用冷水冷却,用水定容至25 ml,摇匀,测吸光度A,以吸光度为纵坐标,葡萄糖的含量为横坐标,绘制标准曲线。
5、3,5二硝基水杨酸(DNS)试剂
,5-二硝基水杨酸用水溶解,,182克酒石酸钾钠,加500ml水,,搅拌溶解,冷却,定容至1000ml,存于棕色瓶中,放置7天后使用。
纤维素酶活力的测定——CMC糖化力法
定义:1毫升液体酶(或1克固体酶粉),在40℃ pH﹦,每分钟水解羧甲基纤维素钠(CMC-Na),,即为1个酶活单位,以u/g(u/ml)表示。
原理:
CMC-Na在纤维素酶的作用下,水解产生纤维寡糖、纤维二糖、葡萄糖等还原糖,还原糖能将3,5﹣二硝基水杨酸中的硝基还原成橙黄色的氨基化合物,在540nm波长下测定吸光度值A,吸光度与酶活成正比。CMC-Na糖化力主要代表内切β--葡聚糖的活力。
试剂:
﹦﹣醋酸