两种常用纤维素酶活力测定方法---滤纸酶活-CMC酶活.doc

检测纤维素酶酶活力—滤纸酶活力(FPA) 滤纸酶活力代表了纤维素酶的三种酶组分协同作用后的总酶活。采用 3,5 一二硝基水杨酸法测定酶活: ( 简称 DNS 法) 1 、原理:纤维素经纤维素酶水解后生成还原糖,还原糖能将 3,5 一二硝基水杨酸中硝基还原成氨基, 溶液变为橙色的氨基化合物,即:3 一氨基一 5 二硝基水杨酸, 在一定的还原糖浓度范围内,橙色的深度与还原糖的浓度成正比,据此可以推算出纤维素酶的活力。 2 、采用的滤纸酶活单位定义: 滤纸酶活反映了纤维素酶的 3 种水解酶,即内切型葡聚糖酶、外切型葡聚糖酶和β葡聚糖苷酶组成的诱导复合酶系的协同水解纤维素能力。是该菌株整个纤维素酶系的酶活力水平的综合体现。代表了纤维素酶的三种酶组分协同作用后的总酶活。在此滤纸酶活单位定义为:以滤纸为底物,在一定反应条件( , 50℃,恒温 lh) 下, 以水解反应中, 1ml 纤维素酶液 1min 催化纤维素生成 lug 葡萄糖为 1 个滤纸酶活单位,以 U 表示。 3 、滤纸酶活力(FPA) 的测定: 1取0. 5ml 适当稀释的酶液,加入 PH 值为 , 的乙酸- 乙酸钠缓冲液 lml 或柠檬酸- 柠檬酸钠缓冲液 lml ; 2 再加入 50± 滤纸(1cmx6cm) 一条,于 50℃保温酶解反应 1 小时,( 先预热 5 分钟); 3 加入 DNS 显色液 3ml( 标准曲线用量是 ) , 放入已沸腾的水中沸水浴 lOmin , 流水冷却后在 540nm 下测吸光度; 4 同时用 100 ℃煮沸 lOmin 后失活的酶液做对照,扣除本底; 5 根据吸光度从葡萄糖标准曲线中查出相应的葡萄糖含量, 根据生成的葡萄糖克数计算出酶活值。滤纸酶活按下面公式计算: X=( WxNxlOOO )/( TxM ) X: 为滤纸酶酶活力,单位 U/ mL。 W: 为从葡萄糖标准曲线中查得的葡萄糖的浓度。 N: 为酶液稀释总倍数。 T: 为反应时间。 M: 为样品的体积。 4 、葡萄糖标准曲线绘制方法标准曲线绘制:取 25ml 具塞刻度试管 6支, 加入 mg /ml 的葡萄糖标准溶液 、 、 、 、 、 , 加蒸馏水 、 、 、 、 、 , 加 DNS 试剂 ml ,混匀后在沸水浴中加热 5 分钟,取出立即用冷水冷却,用水定容至 25 ml ,摇匀,测吸光度 A ,以吸光度为纵坐标,葡萄糖的含量为横坐标,绘制标准曲线。 5、3,5 二硝基水杨酸( DNS )试剂称取 克 3,5- 二硝基水杨酸用水溶解,加入 克 NaOH , 182 克酒石酸钾钠,加 500m l 水,加热溶解后再加入 克重蒸酚和 克亚硫酸钠,搅拌溶解,冷却,定容至 1000ml , 存于棕色瓶中,放置 7 天后使用。纤维素酶活力的测定—— CMC 糖化力法 1、定义:1 毫升液体酶(或 1 克固体酶粉) ,在 40℃ pH ﹦ 条件下,每分钟水解羧甲基纤维素钠( CMC-Na ) ,产生 的葡萄糖,即为 1 个酶活单位,以 u/g ( u/ml )表示。 2、原理: CMC-N