[优秀论文]核转录因子PPARγ2诱导脂肪细胞分化及其分子机制研究.pdf

上海第二医科大学
博士学位论文
核转录因子PPARγ2诱导脂肪细胞分化及其分子机制研究
姓名:左祥生
申请学位级别:博士
专业:内科学内分泌及代谢病
指导教师:罗敏

核转录因子盏贾鞠赴只捌浞肿踊蒲芯中文摘要多严重疾病的共同致病基础。挝氧化物酶体增殖体激活受体在诱导脂肪方法进一步研究庞盏贾鞠赴只姆肿踊疲酝即臃肿铀讲髦鞠基因,构建重组质粒/脚杏ü庑蛄胁舛ǎ缓笥醚衾胱又中的∈驪聊日趋成为世界性的健康问题,而且是冠心病、高血压、吞悄虿〖案咧V⒌刃即在体外建立脂肪细胞分化模型,然后利用该细胞模型,ù又泄ッ餍∈蟾截褐镜嬷欣┰龀鋈ǔ体榈贾刈橹柿痬转染赴妹庖哂ü染色和蛋白免疫印迹检测在细胞表达情况。用—序列经荧光测序,其结果与来源于量在左右,与国外文献报道一致。本结果表明我们扩增的中国昆明小鼠全长序列能够在真核细胞内表达,且表达部位及分子量大小正确,此结果为本课题的进一步研究奠定了基础。脂肪细胞分化包括细胞形态及脂肪细胞特异性基因表达的改变。体内脂肪细胞脂肪细胞增殖与分化异常可导致肥胖及脂肪发育不良等疾病,尤其是肥胖,已细胞特异性基因表达和脂肪细胞分化方面起十分重要作用,然其诱导脂肪细胞分化的分子机制还不清楚。本研究采用了逆转录病毒载体介导小鼠在一定条件下诱导细胞分化成脂肪细胞,┰龅闹泄ッ餍∈驪序列相比,存在一个碱基差异即在罨Τ〈薃,从而产生在被嵛挥蒘媪薃C庖哂ü,与其是核转录因子的特性一致,经由蛋白标准分子量曲线计算蛋白分子分化过程十分复杂,因此从整体水平研究脂肪细胞分化十分困难。本文第二部分即是在体外建立脂肪细胞分化模型,为从细胞及分子水平来研究脂肪细胞分化机制提基因在细胞中表达,胞分化机制。上海第一娇拼笱Р┦垦宦畚
鉴定诱导分化的脂肪细胞中特异性基因蚅泶锴榭觥=峁砻魑颐浅功构建了重组逆转录病毒载体痬。通过对逆转录表达载体进行包装,获得了含较高滴度重组逆转录病毒痬及《镜呐嘌徊部分细胞胞浆含有较多被染成红色的中性脂肪,细胞形态由的梭形变成圆形,且细胞核移向细胞一侧,与体内成熟脂肪细胞形态相似,这些细胞被称之为诱导分供条件。我们从重组质粒/兴盖胁穖基因序列,亚克隆入逆转录病毒载体泄菇ㄖ刈槟孀B疾《驹靥錺/S醚离子脂质体榈贾刈槟孀B疾《驹靥錺/皃转染包装细胞系赴⒂肎锌剐钥寺∩秆。贕嬖谔跫稳定传缓笤谖轌跫律,细胞达%融合,取其上清稀释后感染细胞,并加入痬赴剐钥寺⌒纬珊螅钥剐钥寺〗屑剖扑悴《镜味龋病毒滴度寺∈敛《疽合∈捅妒4淇剐钥寺∩と诤铣善让赶存在条件下稳定传代代,即为痬细胞及细胞。免疫荧光染色及免疫印迹方法来鉴定蛟贜胞中表达情况。取痬和赴又钟孔板中,在含%胎牛血清和痬鹊核氐腄嘌猩ぶ%融合,再在上述培养液中加入牡厝姿膳嘌,最后在培养液胎牛血清和∥胰岛素屑尤“腜,激活物,继续培养天,其间每两天换一次培养液。用甲醛钙固定细胞后,用油红旧赴谥省以经上述同样分化过程的狽赴饕跣远哉障赴M庇肦狿清,病毒滴度分别为痬痬S媚孀B疾《旧锨甯腥綨细胞后,免疫荧光染色可见,痬细胞核呈黄绿色改变,为泶镅粜韵赴鴓细胞核未见上述改变。进一步用油红癏旧ǎ⑾志鲜龇只旌蟮膒/赴校化的脂肪细胞。狽赴鲜龇只蹋醇鲜龈谋洌怀之为阴性对照细胞。—峁崾居盏挤只闹鞠赴唤鲈谙赴翁戏痳,培养螅尤隚生上述特异性改变,而且表达脂肪细胞特异性基因蚅跣远哉障赴骾上海第二医科大学博士学位论文
关键词:逆转录病毒脂肪细胞分化差异显示基因综合上述结果表明,在脂肪细胞分化中起十分重要作用,它可能是通椒ǘ杂盏挤只闹鞠赴鸵跣远哉障赴鞑钜毂泶锘蛏秆。圆钜烀飨外,还发现从分化第炜J迹盏挤只闹鞠赴南赴蛲鍪飨愿哂谝跣远表达蚅颉I鲜鼋峁砻鱒谥鞠赴只谐匾W饔茫它的表达足以诱导脂肪细胞分化过程。为进一步揭示诱导脂肪细胞分化的分子机制,我们用荧光标记的条带进行┰觥/强寺〖靶蛄胁舛āS冒攵縍对方法发现的差异基因作进一步鉴定。同时用流式细胞仪检测了诱导分化的脂肪细胞和阴性对照细胞在不同分化阶段细胞凋亡情况。峁⑾郑盏挤只肪细胞有条差异明显的条带,对其进行疉亚克隆及荧光测序,对照菘猓⑾钟条是小鼠已知基因,跏切∈笮禄颍肴说哪は喙非钙依赖磷脂酶ネ葱裕个小鼠个小鼠新的0攵—峁徊街な盗松鲜个小鼠已知基因中猺上游基因偷蛲鲆种埔蜃是差异表达基因,在诱导分化的脂肪细胞中是上调的,基因是下调的。凋亡检测结果表明诱导分化的脂肪细胞和阴性对照细胞均随着诱导分化时间的延长,细胞凋亡数增加,在分化天达最高峰。另过调控认掠位虻谋泶锢创俳鞠赴只彼滞ü骺谹基因下调来增加分化过程中凋亡细胞数,从而起到调控脂肪细胞分化的作用。照细胞。上海第二医科大学博士学位论文、,
———————————————————————————————————————————