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蛋白质的一级结构(共价结构)
蛋白质的一级结构也称共价结构、主链结构。
蛋白质结构层次
一级结构(氨基酸顺序、共价结构、主链结构)
↓是指蛋白质分子中氨基酸残基的排列顺序
二级结构
↓
超二级结构
↓
构象(高级结构) 结构域
↓
三级结构(球状结构)
↓
四级结构(多亚基聚集体)

一级结构的要点

.
蛋白质测序的一般步骤
祥见 P116
测定蛋白质分子中多肽链的数目。
拆分蛋白质分子中的多肽链。
测定多肽链的氨基酸组成。
断裂链内二硫键。
分析多肽链的N末端和C末端。
多肽链部分裂解成肽段。
测定各个肽段的氨基酸顺序
确定肽段在多肽链中的顺序。
确定多肽链中二硫键的位置。
蛋白质测序的基本策略
对于一个纯蛋白质,理想方法是从N端直接测至C端,但目前只能测60个N端氨基酸。
直接法(测蛋白质的序列)
两种以上特异性裂解法
N C
A 法裂解 A1 A2 A3 A4
B 法裂解 B1 B2 B3 B4
用两种不同的裂解方法,产生两组切点不同的肽段,分离纯化每一个肽段,分离测定两个肽段的氨基酸序列,拼接成一条完整的肽链。
间接法(测核酸序列推断氨基酸序列)
核酸测序,一次可测600-800bp
测序前的准备工作
蛋白质的纯度鉴定
纯度要求,97%以上,且均一,纯度鉴定方法。(两种以上才可靠)
⑴聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)要求一条带
⑵DNS—cl(二甲氨基萘磺酰氯)法测N端氨基酸
测定分子量
用于估算氨基酸残基n=
方法:凝胶过滤法、沉降系数法
确定亚基种类及数目
多亚基蛋白的亚基间有两种结合方式:
⑴非共价键结合
8mol/L尿素,SDS SDS-PAGE测分子量
⑵二硫键结合
过甲酸氧化:
—S—S—+HCOOOH → SO3H
β巯基乙醇还原:
举例:: 血红蛋白(α2β2)
(注意,人的血红蛋白α和β的N端相同。)
分子量: M
拆亚基: M1 、M2 两条带
拆二硫键: M1 、M2 两条带
分子量关系: M = 2M1 + 2M2
测定氨基酸组成
主要是酸水解,同时辅以碱水解。氨基酸分析仪自动进行。
,便于选择裂解方法及试剂。
①Trp测定
对二甲基氨基苯甲醛 590nm。
②Cys 测定
5、5/一二硫代双(—2—硝基苯甲酸)DTNB ,412nm
端基分析
①N端分析
DNS-cl法:最常用,黄色荧光,灵敏度极高,DNS-多肽水解后的DNS-氨基酸不需要提取。
DNFB法:Sanger试剂,DNP-多肽,酸水解,黄色DNP-氨基酸,有机溶剂(乙酸乙酯)抽提分离,纸层析、薄层层析、液相等
PITC法:Edman法,逐步切下。无色PTH-氨基酸,有机溶剂抽提,层析。
②C端分析

H2N-A-B-C-D-COOH 无水肼NH2NH2 100℃ 5-10h。

A-NHNH2 、 B-NHNH2 、 C-NHNH2 、 D-COOH
氨基酸的酰肼,用苯甲醛沉淀,C端在上清中,Gln、Asn、Cys、Arg不能用此法。
(Pro不能测)
羧肽酶A:除Pro、Arg、
羧肽酶B:只水解Arg、Lys
N H2N……………Val—Ser—Gly C
图 P118 羧肽酶法测C末端
肽链的部分裂解和肽段的分离纯化
化学裂解法
①溴化氰—Met—X—产率85%
②亚碘酰基苯甲酸—Trp—X—产率70-100%
③NTCB(2-硝基-5-硫氰苯甲酸)—X—Cys—
④羟胺NH2OH —Asn—Gly—
约150个氨基酸出现一次
酶法裂解
①胰蛋白酶 Lys X
(X ≠ Pro)
Arg—— X
②胰凝乳蛋白酶 Tyr——X
(X ≠ Pro)
Trp——X
Phe——X
胃蛋白酶
Phe(Trp、 Try、 Leu)——Phe(Trp、 Try、 Leu)
③Glu蛋白酶 Glu——X
(V8蛋白酶)
④Arg蛋白酶 Arg——X
⑤Lys蛋白酶 X——Lys
⑥Pro蛋白酶 Pro——X
肽段的分离纯化
①电泳法 SDS-PAGE
根据分子量大小分离
②离子交换层析法(DEAE—Cellulose、DEAE—Sephadex)
根据肽段的电荷特性分离
③反相HPLC法
根据肽段的极性分离
④凝胶过滤
肽段纯度鉴定
分离得到的每一个肽段,需分别鉴定纯度,常用DNS-c l法
要求:SDS-PAGE单带、HPLC单峰、N端