蛋白质的一级结构(共价结构).doc

蛋白质的一级结构(共价结构) 蛋白质的一级结构也称共价结构、主链结构。 1. 蛋白质结构层次一级结构(氨基酸顺序、共价结构、主链结构) ↓是指蛋白质分子中氨基酸残基的排列顺序二级结构↓超二级结构↓构象(高级结构) 结构域↓三级结构( 球状结构)↓四级结构( 多亚基聚集体) 1. 一级结构的要点. 1. 蛋白质测序的一般步骤祥见 P116 (1) 测定蛋白质分子中多肽链的数目。(2) 拆分蛋白质分子中的多肽链。(3) 测定多肽链的氨基酸组成。(4) 断裂链内二硫键。(5) 分析多肽链的 N 末端和 C 末端。(6) 多肽链部分裂解成肽段。(7) 测定各个肽段的氨基酸顺序(8) 确定肽段在多肽链中的顺序。(9) 确定多肽链中二硫键的位置。 1. 蛋白质测序的基本策略对于一个纯蛋白质, 理想方法是从 N 端直接测至 C端, 但目前只能测 60个N 端氨基酸。 1. 直接法(测蛋白质的序列) 两种以上特异性裂解法 NC A 法裂解 A1 A2 A3 A4 B 法裂解 B1 B2 B3 B4 用两种不同的裂解方法, 产生两组切点不同的肽段, 分离纯化每一个肽段, 分离测定两个肽段的氨基酸序列,拼接成一条完整的肽链。 1. 间接法(测核酸序列推断氨基酸序列) 核酸测序,一次可测 600-800 bp 1. 测序前的准备工作 1. 蛋白质的纯度鉴定纯度要求, 97% 以上,且均一,纯度鉴定方法。(两种以上才可靠) ⑴聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE) 要求一条带⑵ DNS — cl (二甲氨基萘磺酰氯)法测 N 端氨基酸 1. 测定分子量用于估算氨基酸残基 n= 方法:凝胶过滤法、沉降系数法 1. 确定亚基种类及数目多亚基蛋白的亚基间有两种结合方式: ⑴非共价键结合 8 mol/L 尿素, SDS SDS-PAGE 测分子量⑵二硫键结合过甲酸氧化: —S—S—+HCOOOH → SO 3H β巯基乙醇还原: 举例:: 血红蛋白(α 2β 2) (注意,人的血红蛋白α和β的N 端相同。) 分子量: M 拆亚基: M 1、M 2 两条带拆二硫键: M 1、M 2 两条带分子量关系: M= 2M 1+ 2M 2 110 mw 1. 测定氨基酸组成主要是酸水解,同时辅以碱水解。氨基酸分析仪自动进行。确定肽链中各种 出现的频率, 便于选择裂解方法及试剂。① Trp 测定对二甲基氨基苯甲醛 590 nm。②C ys 测定 5、5 / 一二硫代双( —2—硝基苯甲酸) DTNB , 412 nm 1. 端基分析①N 端分析 DNS- cl 法:最常用,黄色荧光,灵敏度极高, DNS- 多肽水解后的 DNS- 氨基酸不需要提取。 DNFB 法: Sanger 试剂, DNP- 多肽,酸水解,黄色 DNP- 氨基酸,有机溶剂(乙酸乙酯) 抽提分离,纸层析、薄层层析、液相等 PITC 法: E dman 法,逐步切下。无色 PTH- 氨基酸,有机溶剂抽提,层析。②C 端分析 A .肼解法 H 2 N-A-B-C-D-COOH 无水肼 NH 2 NH 2 100 ℃ 5-10 h。 A-NHNH 2、 B-NHNH 2、 C-NHNH 2、 D-COOH 氨基酸的酰肼,用苯甲醛沉淀, C 端在上清中, G ln、 Asn 、C ys、 Arg 不能用此法。 B .羧肽酶法( P ro 不能测) 羧肽酶 A :除 Pro 、 Arg 、 Lys 外的所有 C端 羧肽酶 B :只水解 A rg、 Lys NH 2N……………V al—S er— Gly C图 P118 羧肽酶法测 C 末端 1. 肽链的部分裂解和肽段的分离纯化 1. 化学裂解法①溴化氰—M et—X—产率 85% ②亚碘酰基苯甲酸—T rp—X—产率 70-100% ③ NTCB ( 2- 硝基-5- 硫氰苯甲酸) —X—C ys—④羟胺 NH 2 OH—A sn— Gly —约 150 个氨基酸出现一次 1. 酶法裂解①胰蛋白酶 L ysX (X≠ Pro) A rg —— X ②胰凝乳蛋白酶 T yr —— X (X≠ Pro) T rp —— X P he —— X 胃蛋白酶 Phe(Trp 、 Try 、 Leu) —— Phe(Trp 、 Try 、 Leu) ③G lu 蛋白酶 G lu —— X (V 8 蛋白酶) ④ Arg 蛋白酶 A rg —— X ⑤L ys 蛋白酶 X —— L ys ⑥ Pro 蛋白酶 Pro —— X 1. 肽段的分离纯化①电泳法 SDS-PAGE 根据分子量大小分离②离子交换层析法( DEAE — Cellulose 、 DEAE — Sephadex ) 根据肽段的电荷特性分离③反相HPLC法根据肽段的极性分离④凝胶过滤 1. 肽段纯度鉴定