蛋白质的一级结构(共价结构).doc

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1. 蛋白质的一级结构（共价结构）
蛋白质的一级结构也称共价结构、主链结构。
2. 蛋白质结构层次
一级结构（氨基酸顺序、共价结构、主链结构）
J 是指蛋白质分子中氨基酸残基的排列顺序
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二级结构
（ $
超二级结构
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\ J
构象（高级结构）"结构域
三级结构（球状结构）
四级结构（多亚基聚集体）
3. 一级结构的要点

祥见P116
(1)
测定蛋白质分子中多肽链的数目。
(2)
拆分蛋白质分子中的多肽链。
(3)
测定多肽链的氨基酸组成。
(4)
断裂链内二硫键。
(5)
分析多肽链的N末端和C末端。
(6)
多肽链部分裂解成肽段。
(7)
测定各个肽段的氨基酸顺序
(8)
确定肽段在多肽链中的顺序。
(9)
确疋多肽链中二硫键的位置。
5. 蛋白质测序的基本策略
对于一个纯蛋白质，理想方法是从 N端直接测至C端，但目前只能测60个N端氨基酸。
6. 直接法（测蛋白质的序列）
两种以上特异性裂解法
N
C
A
法裂解
A1
A2
A3
A4
B
法裂解
B1
B2
B3
B4
用两种不同的裂解方法， 产生两组切点不同的肽段， 分离纯化每一个肽段， 分离测定两个肽
段的氨基酸序列，拼接成一条完整的肽链。
7. 间接法（测核酸序列推断氨基酸序列）
核酸测序，一次可测 600-800bp
8. 测序前的准备工作
9. 蛋白质的纯度鉴定
纯度要求，97鳩上，且均一，纯度鉴定方法。 （两种以上才可靠）
⑴聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）要求一条带
⑵DN— cl （二甲氨基萘磺酰氯）法测 N端氨基酸
10. 测定分子量
用于估算氨基酸残基 n=
mw
方法：凝胶过滤法、沉降系数法 110
11. 确定亚基种类及数目
多亚基蛋白的亚基间有两种结合方式：
⑴非共价键结合
8mol/L尿素，SDS SDS-PAGE 测分子量
⑵二硫键结合
过甲酸氧化：
—S— S—+HCOOOHf SO 3H
3巯基乙醇还原：
举例：：
血红蛋白（a 23 2）
（注意，人的血红蛋白 a和3的N端相同。）
分子量:
M
拆亚基:
M1、M
拆二硫键：
M1、M
分子量关系：
M = 2M 1 + 2M2
两条带
两条带
12. 测定氨基酸组成
主要是酸水解，同时辅以碱水解。氨基酸分析仪自动进行。
，便于选择裂解方法及试剂。
① Trp测定
对二甲基氨基苯甲醛 590nm。
② Cys测定
5 、5/一二硫代双（一2 —硝基苯甲酸） DTNB，412nm
13. 端基分析
① N端分析
DNS-cl法：最常用，黄色荧光，灵敏度极高， DNS多肽水解后的DNS-M基酸不需要提
取。
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DNFB法: Sanger试剂，DNP多肽，酸水解，黄色 DNP氨基酸，有机溶剂（乙酸乙酯） 抽提分离，纸层析、薄层层析、液相等
PITC法：Edman法，逐步切下。无色 PTH-氨基酸，有机溶剂抽提，层析。
② C端分析

H2N-A-B-C-D-COOH 无水肼 NHNH 100 C 5-10h。
A-NHNH
氨基酸的酰肼，用苯甲醛沉淀,
（Pro不能测）
2、B-NHNH、C-NHNH、 D-COOH
C端在上清中，Gin、Asn、Cys、Arg不能用此法。
羧肽酶A：除Pro、Arg、 羧肽酶B：只水解Arg、Lys
N H 2N Vai — Ser — Gly C
图P118 羧肽酶法测C末端
14. 肽链的部分裂解和肽段的分离纯化
15. 化学裂解法
① 溴化氰 —Met—X— 产率85%
② 亚碘酰基苯甲酸 一Trp — X— 产率70-100%
③ NTCB（ 2-硝基-5-硫氰苯甲酸）一X— Cy|—
④ 羟胺 NHOH — Asn— Gly —
约150个氨基酸出现一次
16. 酶法