蛋白质一级结构(共价结构).doc

Forpersonaluseonlyinstudyandresearch;mercialuse羈蛋白质的一级结构(共价结构)蒈蛋白质的一级结构也称共价结构、主链结构。蒄蛋白质结构层次羂一级结构(氨基酸顺序、共价结构、主链结构)莀↓是指蛋白质分子中氨基酸残基的排列顺序袇二级结构膄↓肃超二级结构葿↓芆构象(高级结构)结构域羄↓袁三级结构(球状结构)螁↓蚆四级结构(多亚基聚集体)。葿拆分蛋白质分子中的多肽链。蚇测定多肽链的氨基酸组成。蚆断裂链内二硫键。袄分析多肽链的N末端和C末端。袁多肽链部分裂解成肽段。肇测定各个肽段的氨基酸顺序蒇确定肽段在多肽链中的顺序。蚁确定多肽链中二硫键的位置。罿蛋白质测序的基本策略薆对于一个纯蛋白质,理想方法是从N端直接测至C端,但目前只能测60个N端氨基酸。袃直接法(测蛋白质的序列)螂两种以上特异性裂解法肈NC羅A法裂解A1A2A3A4蚃B法裂解B1B2B3B4螄蒀用两种不同的裂解方法,产生两组切点不同的肽段,分离纯化每一个肽段,分离测定两个肽段的氨基酸序列,拼接成一条完整的肽链。虿间接法(测核酸序列推断氨基酸序列)莄核酸测序,一次可测600-800bp薁测序前的准备工作蕿蛋白质的纯度鉴定肈纯度要求,97%以上,且均一,纯度鉴定方法。(两种以上才可靠)膄⑴聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)要求一条带蚂⑵DNS—cl(二甲氨基萘磺酰氯)法测N端氨基酸羁测定分子量蒈用于估算氨基酸残基n=袅蚄方法:凝胶过滤法、沉降系数法聿确定亚基种类及数目羇多亚基蛋白的亚基间有两种结合方式:薅⑴非共价键结合蒁8mol/L尿素,SDSSDS-PAGE测分子量蒂⑵二硫键结合莆过甲酸氧化:莅—S—S—+HCOOOH→SO3H薃β巯基乙醇还原:薀螆举例::血红蛋白(α2β2)肆(注意,人的血红蛋白α和β的N端相同。)薄分子量:M蚈拆亚基:M1、M2两条带葿拆二硫键:M1、M2两条带袆分子量关系:M=2M1+2M2莁测定氨基酸组成肁主要是酸水解,同时辅以碱水解。氨基酸分析仪自动进行。,便于选择裂解方法及试剂。薆①Trp测定蒃对二甲基氨基苯甲醛590nm。腿②Cys测定莈5、5/一二硫代双(—2—硝基苯甲酸)DTNB,412nm肃端基分析薄①N端分析薂DNS-cl法:最常用,黄色荧光,灵敏度极高,DNS-多肽水解后的DNS-氨基酸不需要提取。螇DNFB法:Sanger试剂,DNP-多肽,酸水解,黄色DNP-氨基酸,有机溶剂(乙酸乙酯)抽提分离,纸层析、薄层层析、液相等螃PITC法:Edman法,逐步切下。无色PTH-氨基酸,有机溶剂抽提,层析。莁②-A-B-C-D-COOH无水肼NH2NH2100℃5-10h。薄莃A-NHNH2、B-NHNH2、C-NHNH2、D-COOH螈氨基酸的酰肼,用苯甲醛沉淀,C端在上清中,Gln、Asn、Cys、Arg不能用此法。(Pro不能测)芄羧肽酶A:除Pro、Arg、:只水解Arg、Lys膁NH2N……………Val—Ser—GlyC肅肄图P118羧肽酶法测C末端节艿肽链的部分裂解和肽段的分离纯化蝿化学裂解法螅①溴化氰—Met—X—产率85%芃②亚碘酰基苯甲酸—Trp—X—产率70-100%蚁③NTCB(2-硝基-5-硫氰苯甲酸)—X—Cys—膈④羟胺NH2OH—Asn—Gly—薅约150个氨基酸出现一次肀酶法裂解螀①胰蛋白酶LysX薇(X≠Pro)芅Arg——X膂袈肇②胰凝乳蛋白酶Tyr——X肆(X≠Pro)膃Trp——X芁蒆Phe——X螆羀胃蛋白酶荿Phe(Trp、Try、Leu)——Phe(Trp、Try、Leu)袆蒇③Glu蛋白酶Glu——X肂(V8蛋白酶)螁④Arg蛋白酶Arg——X蕿羃⑤Lys蛋白酶X——Lys膃袀⑥Pro蛋白酶Pro——X羈肽段的分离纯化螃①电泳法SDS-PAGE羁根据分子量大小分离羈②离子交换层析法(DEAE—Cellulose、DEAE—Sephadex)蒈根据肽段的电荷特性分离蒄③反相HPLC法羂根据肽段的极性分离莀④凝胶过滤袇肽段纯度鉴定膄分离得到的每一个肽段,需分别鉴定纯度,常用DNS-cl法肃要求:SDS-PAGE单带、HPLC单峰、N端单一。(1)耦联螁PITC+H2N—A-B-C-D……pH8—9,40℃PTC——A-B-C-D……蚆蚅(2)裂解袂PTC—A-B-C-D……TFA无水三氟乙酸ATZ—A+H2N—B-C-D袀荿(3)转化蒅ATZ—APTH—A羃用GC或HPLC测定PTH-A肈