脂肪酶活检测原理及方法.doc

脂肪酶活检测原理及方法脂肪酶活检测原理及实际方法:一、(4-Nitrophenylester)是脂肪酶水解活力测定中运用最为广泛的一种底物,脂肪酶水解其产生pNP(对硝基苯酚)在碱性条件下显黄色,在410nm下有吸光值,且灵敏度很高。:CAS碳链长度出货号价格名称830-03-5    C2    N8130-1G￥462    对硝基苯乙酸酯2635-54-9C4  N9876-1G  ￥570对硝基苯丁酸酯1956-10-1   C8    21742-1G-F￥487对硝基苯辛酸酯1956-11-2C12   61716-1G￥435对硝基苯月桂酸酯1492-30-4   C16N2752-1G￥379对硝基苯棕榈酸酯14617-86-8   C18   N3627-1G  ￥,购于sigma公司标准曲线绘制:(2mM,2mmol/L):(p-NP)溶于100ml的溶液B(即不同pH的缓冲液),置于棕色试剂瓶内,4℃冰箱保存。方法一::,,,,,(2mM),用溶液B(即不同pH的缓冲液)稀释至4ml,分别测定在410nm处的吸收值。以对硝基苯酚浓度x(,,,,,,单位:mM)为横坐标,吸光值y为纵坐标,绘制标准曲线。方法二:全部对硝基苯酚经过与测酶活相同的处理,获得吸光度。:分别取0、、、、15、、30、、、、55、、40、、(全部都是),40℃15min,95%乙醇,10000r/min,3min,测出标准曲线。上表是方法一测得标准曲线脂肪酶酶活定义:在410nm下测定吸光值,以1min内催化水解底物对硝基苯棕榈酸酯(p-NPP)产生1μmol对硝基苯酸(p-NP)所需的酶量为1个酶活单位(U)。公式y=+-NP的浓度(单位:mmol/l),y是吸光值,、,R2是相关系数。则,酶活计算公式为:酶活=1000*n*V*(y-)/,t为反应时间(单位:min),V为反应体系的总体积(单位:L)、1000是mmol到μmol的比例。,pH8的37℃的PBS缓冲液中(选择37℃培养箱),每隔5min检测一次颜色变化,拍照;,pH9的Tris-HCl缓冲液中(37℃),每隔5min检测一次颜色变化,拍照;,pH10的Gly-NaOH缓冲液。测酶活所需要试剂的配制,酶活测定方法方法一:(96孔板法,粗略,速度快)溶液的配制溶液A:溶液A:(p-NPP,Sigma,或者其他底物,,*10-5mol)(*10-3M,),4℃棕色瓶(可以使用包锡箔纸的15ml离心管)保存,每10ml可用于单个酶500次测定;溶液B:缓冲液(pH缓冲液,可更改)-100,混匀,4℃保存。96孔板(220μL):A液(底物液):18μL↗体系液180(μL)+酶液(40μL)↘B液(pH缓冲液):162μL此步骤中,底物再次被稀释,。方法二:(吸光度法,精准,速度慢):(p-NPP,Sigma,或者其他底物),4℃棕色瓶(可以使用包锡箔纸的15ml离心管)保存,每10ml可用于单个酶8-10次测定,或用于8-10个酶一次测定,或用于一个酶4次密精测定;溶液B:缓冲液(pH缓冲液,可更改)-100,混匀,4℃保存。(以单个酶液做一个/两个对照为例)①准备试管30个,10个15ml离心管;②取1ml/,充分混匀,37℃水浴保温5min,分装至3/4个试管中,,即体系液;③向每个试管中加入适量酶液(粗酶液加300μL),对照组中加入灭活酶液(沸水煮沸5min),加入酶液后即为反应液;④37℃反应10-15min,加入95%乙醇终止