ThermoScientificRevertAidFirstStrandcDNASynthesisKitK1621说明书第一链cDNA合成试剂盒.docx

Thermo-Scientific-RevertAid-First-Strand-cDNA-Synthesis-Kit-K1621说明书(第一链cDNA合成试剂盒)————————————————————————————————作者:————————————————————————————————日期: RevertAid™第一链cDNASynthesis试剂盒#K1621,#K1622分析证明书#K1621Lot质量控制采用100fg对照GAPDHRNA和对照引物进行RT-PCR反应,通过在1%琼脂糖上进行凝胶电泳和溴化乙锭染色显示得到足够量的496bp的产物质量认证人:JurgitaZilinskiene目录页码试剂盒组成…………………………………………………………….2存储条件……………………………………………………………….2产品说明……………………………………………………………….2注意事项…………………………………………………………….....3操作步骤…………………………………………………………….....6RT-PCR…………………………………………………………….6合成cDNA用于克隆………..………………………………………7实验对照……………………………………………………………….8问题分析与解决……………………………………………………...10试剂盒成分RevertAid™第一链cDNA合成试剂盒20次#K1621100次#K1622RevertAid™M-MuLV反转录酶(200u*/μl)25μl120μlRiboLock™RNA酶抑制剂(20u**/μl)25μl120μl5×反应缓冲液(250mMTris-HCl(),250mMKCl,20mMMgCl2,50mMDTT)150μl500μl10mMdNTP混合物50μl250μlOligo(dT)18引物100μM,(15A260u/ml)25μl120μl随机六聚体引物100μM,(6A260u/ml)25μl120μlGAPDH正向引物,10μM5’–ATGACAACTTTG–3’20μl20μlGAPDH反向引物,10μM5’–TGTTGCTGTAG-3’’-poly(A)tailedRNAtranscript,.25ml*一个单位的RevertAid™M-MLV逆转录酶在37℃10分钟将1nmol的dTMP转化为多核苷酸组分(吸附在DE81上)。**一个单位的RiboLock™RNase酶抑制剂抑制5ngRNA酶A50%的活性。存储条件试剂盒中所有组分应存储在-20°C。对照用RNA可存储于-70°C以便长期使用。产品说明RevertAid™第一链cDNA合成试剂盒以mRNA或者总RNA为模板,高效合成第一链cDNA。本试剂盒使用RevertAid™M-MuLV反转录酶,它的RNA酶H的活性与AMV反转录酶相比较低。该反转录酶可耐受42-50°C温度,合成的cDNA片段长度达13kb。试剂盒中含有RiboLock™重组RNA酶抑制剂,防止RNA降解,可耐受55°C高温。试剂盒同时含有oligo(dT)18和随机六聚体引物。随机六聚体引物与模板非特异性地结合,以总RNA中任何RNA为模板合成cDNA。oligo(dT)18选择性和RNA3’poly(A)配对结合,只以有poly(A)尾巴的mRNA为模板合成cDNA。使用本试剂盒也可采用序列特异性引物。合成的第一链cDNA能直接用作PCR或荧光定量PCR的模板,第二链cDNA的合成或线性RNA扩增,也可用于需要用带有放射性或非放射性核苷酸标记第一链cDNA的实验,比如将标记好的第一链cDNA作为杂交实验中的探针或者用于微阵列分析。注意事项避免核酸酶污染RNA的纯度和完整性对于合成全长cDNA至关重要。RNA很容易被RNA酶A降解,而RNA酶A广泛稳定地存在于实验室中。试剂盒中的所有成分都经过了无RNA酶的严格验证并保证不含有RNA酶。为防止污染,实验室和所有实验准备工作都必须保证没有RNA酶污染。避免RNA酶污染的常规建议:●用DEPC处理实验用到的所有管子和枪头,或者购买已经证明无核酸酶的实验用具。●整个实验过程戴手套,因为皮肤是RNA酶的一个常见来源。并经常更换手套。●使用无RNA酶的试剂,即使是超纯水也要确保无RNA酶(比如#R0581,无RNA酶的高纯度水)●使用RNA酶抑制剂,比如试剂盒中提供的FermentasRiboLock™RNA酶抑制剂来保护RNA。●试剂盒如不使用,要严格密封保存。在反转录过程中,所有管子要确保