江浙短尾蝮蛇毒纤溶酶原激活剂的药代动力学过程道.doc

江浙短尾蝮蛇毒纤溶酶原激活剂的药代动力学过程道福建医科大学硕士学位论文江浙短尾蝮蛇毒纤溶酶原激活剂的药代动力学过程姓名:林丽丽申请学位级别:硕士专业:药理学指导教师:许云禄20090601短尾蝮蛇毒纤溶酶原激活剂的药代动力学研究江浙短尾蝮蛇毒纤溶酶原激活剂的药代动力学研究摘要蛇毒中含有较多的影响血液系统功能的活性组分,如:凝血酶样酶、解离素、纤溶酶、纤溶酶原激活剂、凝血,因子激活剂等,特别是在蝮科和蝰科蛇毒中尤为突出。,,,,年,中科院昆明动物研究所的张云等〔,,首先报道从竹叶青蛇(,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,)蛇毒中分离纯化出具有激活纤溶酶原作用的蛋白酶(,,,(,,),以及对,,,(,,的大量后续研究,为新型溶栓药物的开发提供了新的思路。本实验室已成功从江浙短尾蝮(,,,,,,,,,,,,,;,,,,,)蛇毒中分离纯化出短尾蝮蛇毒纤溶酶原激活剂(,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,二,,),并通过动物实验证实它对动物实验性血栓具有治疗和预防作用。为了全面了解,,,,,,的药理学特点,本课题拟研究在动物体内的药物代谢动力学,为进一步的开发研究提供初步的药代动力学数据。,(,,,,,,的分离纯化及部分理化性质测定,,】,,,,,,,的分离纯化短尾蝮粗蛇毒用苯甲脒(琼脂糖凝胶(,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,)亲和层析,得到两个蛋白峰,收集具有酶活性的第二峰,经浓缩后再用,,,,,,,,,(,,凝胶过滤层析进一步纯化,得到,个蛋白峰,经纤维蛋白平板法鉴定第,,峰的降支具有激活纤溶酶原,间接溶解纤维蛋白的作用,该组分再过,,;,,,,,,,,,,,,(,,,,,反相色谱柱,得到纯品,,,,,,。【,,,,,,,,,的理化性质,,,,,,经十二烷基硫酸钠(聚丙烯酰胺凝胶电泳(,,,(,,,,)。在,(巯基乙醇还原和非还原条件下,均显示单一条带,即其为单一肽链的蛋白质,分子量为,,,,,左右。,(,,,,,,抗体的分离纯化及部分理化性质测定,,,,,,,,,,抗体的分离纯化应用已活化的,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,琼脂糖凝胶与,,,,,,反应,将,,,,,,偶联在琼脂糖凝胶的活化臂上,再用亲和层析的原理,用自制的琼脂糖凝胶分离纯化蝮蛇毒抗血清,得到两个蛋白峰并收集第二个蛋白峰。短尾蝮蛇毒纤溶酶原激活剂的药代动力学研究【,,,,,,,,抗体的理化性质,,,,,,抗体与短尾蝮粗蛇毒经苯甲脒(琼脂糖亲和层析后的第二峰和纯品经双向免疫扩散活后,可见清晰的免疫沉淀线,且各沉淀线之间互相融合。,(抑制性,,(,,,,,测定,,,,,,血药浓度,(,抑制性,,(,,,,,检测方法采用,,孔酶标板,每孔加入含有,,,,,,的包被缓冲液,,,,,,包板,,”,过夜,用洗涤缓冲液(,,,,)洗涤三次,每次,,,,后,加入封闭缓冲液含,,,,(,,,孔,,,?封闭,,,,,,,,,,,洗涤。同时经适当稀释后的待测样品与定量抗体置,,”,,孵育,,,,,,后,每孔加入反应后的样品,,,,,,,,孔,,,。,温育,,,,,,,,,,,洗涤。再加入生物素标记的二抗,,,?孵育,,,,,,,,,,,洗涤,加入,,,标记的亲和素,,,”(,反应,,,,,后,加入邻苯二胺(,,,)底物,,,,,,孔显色,,,?,,,,,,后立即加入,,,,,,硫酸,,,,,,终止反应,于,,,,,内用,,,,,,,,,,,,型酶标仪测定,,,哪值。,(,最适包被抗原浓度固定,,,,,,抗体、二抗及亲和素(,,,的浓度,用包被缓冲液配成系列稀释的抗原溶液,按上述流程进行,,,,,测定。以含,,,,,,抗体而不含,,,,,,的,,,,,,犬血浆的,,,,,值为,(,,不含,,,,,,抗体也不含,,,,,,血浆的,,,,帆值最小时的包被抗原浓度为最佳包被浓度,则最佳包被抗原浓度为,(,,,,,,,。,(,最适,,,,,,抗体浓度固定,,,,,,、二抗和亲和素(,,,的浓度,用稀释缓冲液配成系列稀释的,,,,,,抗体溶液,操作同上。以含,,,,,,抗体而不含,,,,,,的,,,,,,犬血浆的,,,枷值为,(,,不含,,,,,,抗体也不含,,,,,,血浆的,‰值最小时的包被抗原浓度为最佳包被浓度,则最佳抗体浓度为,(,,,,,,,,,,(,标准曲线的建立及灵敏度检测用,,倍稀释后的空白,,,,,,犬血浆系列稀释,,,,,,,在包被抗原浓度为,(,,(,,,,,,抗体浓度为,(,,,,„,,,,,的条件下进行,,,,,测定,所得?,,,岫值与,,,,,,的对数剂量进行直线回归,在抗原为,,,,,,”,(,,,,,,,,的线性范围内,标准曲线为:,,,(,,,,,,,(,,,,,,,,,