短尾蝮蛇毒纤溶酶原激活剂的分离纯化及其活性测定.pdf

短尾蝮蛇毒纤溶酶原激活剂的分离纯化及活性测定短尾蝮蛇毒纤溶酶原激活剂的分离纯化及活性测定摘要蛇毒中含有较多的影响血液系统功能的活性组分,如:凝皿酶样酶、解离素、纤溶酶、纤溶酶原激活剂、凝血X因子激活剂等,特别是在蝮科和蝰科蛇毒中尤为突出。 1993年,张云首次从竹叶青蛇毒中分离纯化出蛇毒纤溶酶原激活剂(TSV-PA),为从蛇毒中开发新型抗栓药物提供新的课题,本课题旨在从江浙产短尾蝮(Gloydius brev七audus)蛇毒中分离纯化出短尾蝮蛇毒纤溶酶原激活剂(plasminogen activator ofGloydius brevicaudus venom GBV-PA),并对其理化性质及部分生物学活性进行研究,为寻找较好的抗血栓药物提供实验依据。 -PA的分离纯化及部分理化性质测定 —PA的分离纯化应用苯甲脒一琼脂糖凝胶(Benzamidine Sepharose 6B)亲和层析,得到两个蛋白峰,经纤维蛋白平板法鉴定第1I峰有激活纤溶酶原间接溶解纤维蛋白的作用,该组分再过Lichrospher ,得到纯品GBV-PA。 —PA的理化性质 GBV-PA经十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)。,均显示单一条带,即其为单一肽链的蛋白质,分子量为40kDa左右。采用聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳测定其等电点(pI)。 —PA的生物学活性测定 -PA的比活性采用发色底物法(),证明GBV-PA能特异的激活人纤溶酶原为纤溶酶而降解纤维蛋白,且呈现一定的时效和量效关系。 t-PAIU/mg。 -PA酶学特性测定 GBV-PA活性可被丝氨酸蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(PMSF)和苯甲脒(Benzamidine)所抑制,。说llJ]GBV-PA 为丝氨酸蛋白酶,而非金属蛋白酶。-PA, 短尾蝮蛇毒纤溶酶原激活剂的分离纯化及活性测定对纤维蛋白无亲和性。 -PA体内的抗血栓作用 3,lGBV-PA对静脉血栓的溶栓作用采用家兔耳缘静脉血栓模型,观察GBV-PA iv给药对家兔实验性静脉血栓的作用,结果发现GBV-PA50和100 ug&g iv对于已形成的家兔耳缘静脉血栓,可促进血栓消退,缩短血管再开通时间,即对动物实验性血栓具有治疗作用。 3,。观察GBV-PA iv给药对家兔实验性动脉血栓的作用。结果发现GBV-PA300ug/kgiv给药后血栓重量较其他组明显减轻(P<), 这表明GBV-PA对家兔的动脉血栓也有溶解作用。 3。3GBV-PA对血栓形成的影响利用Chandter旋转环进行体外血栓形成实验,结果发现GBV-PA 50、 100ug/kg在给药后3、8和24h均可明显减少体外血栓的长度和湿重。这表明 GBV-PA具有提高家兔血浆纤溶活性,促进纤维蛋白(原)降解,产生防栓和溶栓作用。 -PA对家兔血浆纤溶活性的影响测定给药前及给药后3h、8h和24h家兔血浆优球蛋白溶解时间,结果表明 GBV-PA50、100ug&g在给药后3h、8h、24h均可明显缩短家兔血浆优球蛋白溶解时间(p<),阳性对照药尿激酶虽然可使血管再通时间缩短,但在给药后 3、8和24h对优球蛋白溶解时闻已无明显影响。 -PAx对血小板作用研究 4,1GBV-PA对血小板聚集的影响采用经典的Bom法,测定GBV-PA对ADP、凝血酶诱导的体外血小板聚集的影响。结果显示,GBV-PA对ADP和凝血酶诱导的血小板聚集均有抑制作用,且呈明显的量效关系。 -PA对小鼠急性肺栓塞的作用采用ADP—Na:诱导的小鼠急性肺栓塞模型,结果表明GBV-PA 150ug/kg和 200ug/kg ivADP—Na诱导的急性肺栓塞具有明显的缓解作用,提示GBV—PA在体内 4 短尾蝮蛇毒纤溶酶原激活剂的分离纯化及活性测定对/tOP—Na诱发的血小板聚集具有抑制作用。结论:从江浙短尾蝮蛇毒中分离得到一个GBV-PA纯品,分子量为40kDa左右, 。发色底物法(S一2390)法证明GBV-PA能特异的激活人纤溶酶原为纤溶酶而降解纤维蛋白,。GBV-PA为一种丝氨酸蛋白酶,与纤维蛋白无特异性的亲和力。在体外可抑制ADP和凝血酶诱导的血小板聚集,体内对ADP诱导的急性肺栓塞综合征有明显的缓解作用。GBV-PA对家兔实验性动、静血栓均有治疗作用,同时可明显抑制家兔体外血栓的形成