江浙短尾蝮蛇毒纤溶酶原激活剂的药代动力学过程.pdf

短尾蝮蛇毒纤溶酶原激活剂的药代动力学研究江浙短尾蝮蛇毒纤溶酶原激活剂的药代动力学研究摘要蛇毒中含有较多的影响血液系统功能的活性组分,如:凝血酶样酶、解离素、纤溶酶、纤溶酶原激活剂、凝血X因子激活剂等,特别是在蝮科和蝰科蛇毒中尤为突出。1993年,中科院昆明动物研究所的张云等[11首先报道从竹叶青蛇(Trimeresurusstejnegeri)蛇毒中分离纯化出具有激活纤溶酶原作用的蛋白酶(),,为新型溶栓药物的开发提供了新的思路。本实验室已成功从江浙短尾蝮(Gloydiusbrevicaudus)蛇毒中分离纯化出短尾蝮蛇毒纤溶酶原激活剂(plasminogenactivatorofGloydiusbrevicaudusvenom,GBV二PA),并通过动物实验证实它对动物实验性血栓具有治疗和预防作用。为了全面了解GBV-PA的药理学特点,本课题拟研究在动物体内的药物代谢动力学,为进一步的开发研究提供初步的药代动力学数据。-PA的分离纯化及部分理化性质测定GBV-(BenzamidineSepharose6B)亲和层析,得到两个蛋白峰,收集具有酶活性的第二峰,,得到3个蛋白峰,经纤维蛋白平板法鉴定第1I峰的降支具有激活纤溶酶原,间接溶解纤维蛋白的作用,,得到纯品GBV-PA。GBV-PA的理化性质GBV-()。,均显示单一条带,即其为单一肽链的蛋白质,分子量为40kDa左右。-PA抗体的分离纯化及部分理化性质测定GBV-Br-activatedSepharose4B琼脂糖凝胶与GBV-PA反应,将GBV-PA偶联在琼脂糖凝胶的活化臂上,再用亲和层析的原理,用自制的琼脂糖凝胶分离纯化蝮蛇毒抗血清,得到两个蛋白峰并收集第二个蛋白峰。短尾蝮蛇毒纤溶酶原激活剂的药代动力学研究【2lGBV-PA抗体的理化性质GBV-,可见清晰的免疫沉淀线,且各沉淀线之间互相融合。-,每孔加入含有GBV-PA的包被缓冲液100111包板,4"C过夜,用洗涤缓冲液(PBST)洗涤三次,每次3min后,,37℃封闭120min,PBST洗涤。同时经适当稀释后的待测样品与定量抗体置37"C,孵育120min后,每孔加入反应后的样品,100I-d/孔,37。C温育120min,PBST洗涤。再加入生物素标记的二抗,37℃孵育120min,PBST洗涤,加入HRP标记的亲和素,37"(2反应40min后,加入邻苯二胺(OPD)底物looul/孔显色,37℃,30min后立即加入2mol/L硫酸50I-tl终止反应,于30min内用MulfiskanMK3型酶标仪测定~92哪值。-PA抗体、,用包被缓冲液配成系列稀释的抗原溶液,按上述流程进行ELISA测定。以含GBV-PA抗体而不含GBV-,不含GBV-PA抗体也不含GBV-PA血浆的A492帆值最小时的包被抗原浓度为最佳包被浓度,,g/ml。-PA抗体浓度固定GBV-PA、,用稀释缓冲液配成系列稀释的GBV-PA抗体溶液,操作同上。以含GBV-PA抗体而不含GBV-PA的Beagle犬血浆的~,不含GBV-PA抗体也不含GBV-PA血浆的~‰值最小时的包被抗原浓度为最佳包被浓度,-PA,,‘3U/ml的条件下进行ELISA测定,所得△~92岫值与GBV-PA的对数剂量进行直线回归,在抗原为1ng/ml"-.-32ng/ml的线性范围内,标准曲线为:y=+,r---。检测水平达到lng/rrd。、,雌雄兼用,分为单次静脉给药组和动脉局部给药组,前者分别静注GBV-PA75和3