can信号通路调控白念珠菌基因rta2的表达机制及功能研究.doc

药理学专业毕业论文[精品论文]CaN信号通路调控白念珠菌基因RTA2的表达机制及功能研究关键词:白念珠菌钙调神经磷酸酶RTA2基因转录调控机制CaN通路转录因子摘要:白念珠菌耐药是抗真菌治疗失败的主要原因,白念珠菌钙调神经磷酸酶(CAN)通路与耐药性产生密切相关,我们的前期研究发现RTA2基因是CaN通路调节白念珠菌对唑类药物的耐药性产生的必需基因,但RTA2的转录调控机制目前尚不清楚。A(CaN催化亚单位编码基因)缺失菌DSY2101(()/()cna)和CRZ1(CaN通路转录因子Crzlp编码基因)缺失菌DSY2195(()/()crzl)中的缺失菌DJY201(()/()cna()/()rta2)、MJY201(()/()crzl()/()rta2)。然后利用微量液基稀释法考察了在白念珠菌CAF2-1(野生菌)、DSY2091(()/()cna)、DJY201(()/()cna()/()rta2)、A回复菌)、DSY2195(()/()crzl)、MJY201(()/()crzl()/()rta2)和MKY268(CRZ1回复菌)中,加入细胞外钙离子对氟康唑的抗真菌活性的影响。结果发现:在白念珠野生型菌CAF2-1中,();在DSY2091、DJY201、DSY2195和MJY201中,;在CNA回复菌DSY2115和CRZ1回复菌MKY268中,(),证明RTA2基因是CaN通路调节白念珠菌对唑类药物的耐药性产生的靶基因。本课题又利用报告基因法研究RTA2基因的转录调控机制。首先设计引物,利用Pyrobest高保真酶PCR扩增报告基因RLUC,并与白念珠菌ACT1基因的终止片段融合,克隆到质粒pBES116,得到载体pBES-RLUC-ACT1,然后再利用Pyrobest高保真酶PCR扩增RTA2起始密码子上游973bp、785bp、455bp、440bp和274bp序列,分别克隆到载体pBES-RLUC-ACT1,得到的报告基因载体分别命名为pBES-R1、2、3、4、5,分别转化CRZ1缺失菌和RTA2缺失菌后,利用CaCl2激活CaN信号转导通路,提取蛋白,加入RLUC的底物coelentrazine,测定RLUC的活性,结果发现:CRZl缺失菌转入质粒pBES-RTA1,2-5转化子的报告基因RLUC的活性低,证明RTA2基因是CaN通路转录因子Crzlp调控的靶基因,进一步筛选得到CaN信号转导通路调控RTA2基因的调控元件位于RTA2起始密码子上游455bp到785bp的区域内。综上所述,本课题研究证明RTA2基因是CaN通路转录因子Crzlp调控的靶基因,筛选确定RTA2基因表达的调控元件位于起始密码子上游455bp到785bp的区域内。