支原体检测试剂盒(常规PCR).doc

eM®支原体检测试剂盒(常规PCR)货号::引物和脱氧核苷酸三磷酸盐dATP、dCTP、dGTP和dTTP;25个反应PCR10倍浓缩反应缓冲液蓝色瓶盖740µl阳性对照DNA绿色瓶盖含有支原体基因组的DNA片段,非传染性,冻干内控对照DNA黄色瓶盖质粒DNA,非传染性,-8°C保存。重悬引物/核苷酸Mix及阳性对照和内控对照DNA后,应置于-18°C以下保存。避免反复冻融。如果每次进行检测的样本很少,应将以上三种试剂分装。(特殊反应)PCR管DNA电泳设备离心机,加样器去离子水,无DNA水聚合酶注意:使用MinervaTaq酶效果最好。也可以用其它厂家的Taq酶,但一定要用与酶相配的缓冲液,并调节Mg离子浓度到3mM。推荐使用的Taq酶表见网址:.com。原理该试剂盒应用的引物对支原体高度保存的rRNA操纵子(支原体基因组中16SrRNA的编码区序列),具有很高的特异性,可以检出含有1-5个支原体DNA片段及2-5个支原体的样本。而且,对于真核和细菌DNA不产生扩增效应。试剂盒中还提供内控对照,在DNA电泳上会显示191bp的条带,内控对照是PCR反应成功的标志。因此,只需一种方法就可以检测出几乎所有的支原体种类,而且,所有操作只需3小时即可完成。<2x103个/ml支原体的水平时,即使加入抗生素去除,也会由于耐药反应,使细胞株中的支原体继续存在。因此,检测前,应在不含抗生素的情况下,将待检测的细胞株进行培养,至少培养一代。样品应取自生长密度已达到90-100%的细胞。在培养时间较长的培养基中,可能会发现有PCR抑制物的积聚。检测前,必须对样本进行DNA提取。为了避免出现假阳性结果,我们建议使用去离子的、无DNA水,带滤芯的tip头和手套。PCR模板的准备:将细胞培养基上清液煮沸5分钟,或用其他生物方法准备模板。操作步骤如下:µl上清液加入到已消毒的离心管中。将瓶盖密封好,以防止加热时瓶盖打开。,煮沸至95°C或温育5分钟。,将样本的上清液离心5秒钟,使细胞碎片沉积成球状。-装有冻干成分的离心管以最大转速离心5秒钟;-加入适量的去离子及无DNA水。引物/核苷酸混合物(每25个反应)130µl阳性对照DNA100µl内控对照DNA220µl-室温下温育5分钟-混匀并离心注意:所有操作需在冰上进行,将重悬后的试剂低于-18°C保存。。根据PCR仪加热的速度,确定进行两个标准PCR反应,还是一个标准反应和一个快速反应。标准反应快速反应1个循环94°C,2分钟1个循环94°C,2分钟55°C,2分钟72°C,2分钟34个循环94°C,30秒钟35个循环94°C,30秒钟55°C,1分钟55°C,30秒钟72°C,1分钟72°C,30秒钟1个循环72°C,4分钟冷却至4-8°C冷却至4-8°C注意:温育的时间根据使用聚合酶的情况而定。当温度达到94°C时,热启动酶活化。请参照聚合酶数据表确定加热时间。