卵类粘蛋白柱手性拆分酮基布洛芬.docx

, 曹桂芳,徐诗伟中国科学院微生物研究所,北京100080)摘要:在卵类粘蛋白柱上,考察了酮洛芬对映体在3种流动相体系下的保留行为,建立了同时分离酮洛芬及其甲酯两对对映体的较佳色谱条件。方法可用于酶法立体选择性水解或酯化过程中生成的4种化合物的同时测定。关键词:高效液相色谱法;卵类粘蛋白;酮洛芬及其甲酯;手性拆分中图分类号:O658;R9 文献标识码:A 文章编号:10008713(2000)060536031 前言酮基布洛芬[简称酮洛芬,化学名()2(3苯甲酰苯基)丙酸]是一种优良的非甾体抗炎镇痛药。S(+)构型具有较高生理或药理活性,而R(-)酮洛芬对牙周病有极好的防治作用。对手性药物酮洛芬的拆分研究,不仅可提高其外消旋体的疗效,降低药物毒性,还可以将两种对映体分别开发为不同适应症的治疗药物[1]。为此,我们开展酶法立体选择性水解或酯化拆分酮洛芬的研究,首先要建立一种简便快速分离对映体和测定对映体过量(.)的方法[2]。天然蛋白质通常有较高的手性识别能力,对手性药物对映体选择性高。现有多种蛋白质,如牛血清白蛋白(BSA)、酸性糖蛋白(AGP)、人血清白蛋白(HSA)、胃蛋白酶(pepsin)和卵类粘蛋白(OVM)等[3~7]键合微粒硅胶的手性固定相被商品化。卵类粘蛋白是一类新型的蛋白质色谱填料,具有众多手性识别位点和宽的对映选择范围,已被应用于一些药物的手性拆分[8~10]。本文建立了用卵类粘蛋白柱同时分离酮洛芬及其甲酯两对对映体的高效液相色谱(HPLC)分析方法,考察了一些热力学因素对酮洛芬对映体分离的影响,并比较了3种流动相体系下的手性拆分效果。材料和方法21 仪器和试剂法国GilsonHPLC仪;SP4290积分仪;DiGiSensepH计(ColeParmer)。乙腈(Fluka)为色谱纯;甲醇、乙醇(北京化工厂)和KH2PO4(北京红星化工)等试剂均为分析纯;酮洛芬(KE)样品由西南合成制药厂赠送,酮洛芬甲酯(MKE)样品由本实验室化学合成。22 色谱条件色谱柱UltronESOVM(5 m,150mm .)购自惠普公司;流动相以磷酸盐(KH2PO4)溶液为主体,选择乙腈、甲醇和乙醇作为改良添加剂,流速(F)08mL/min~12mL/min;检测波长255nm,检测灵敏度01AUFS;纸速025cm/min;柱温为室温;进样量4L。23样品制备分别在电子天平(Sartorius)上准确称取20mg样品(KE和MKE),用甲醇20mmol/LKH2PO4(pH30)(体积比为35)溶液各自配制成质量浓度为025g/L的溶液。同时分离KE和MKE时,上述溶液以11的体积比混合进样。结果与讨论1流动相组成对分离的影响试验了流动相中添加不同体积分数的有机溶剂甲醇、乙醇和乙腈)对手性分离的影响。为了保护蛋白柱免受破坏,流动相中有机溶剂的体积分数不宜超过50%。311甲醇体积分数的影响表1为不同体积比的甲醇和30mmol/LKH2PO4(pH30)组成的流动相对酮洛芬对映体分离的容量因子(k)和分离度Rs)的影响。在该流动相体系中,甲醇比例增加,k值减小,而Rs值明