肝糖原的提取与鉴定实验报告.docx

肝糖原的提取与鉴定实验报告实验六肝糖原的提取实验六肝糖原的提取、鉴定与定量(生物化学实验操作考核卷)姓名,学号,专业,级班组,月日目的要求:掌握组织样品的制备方法,了解其注意事项。了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定糖原含量的原理和注意事项,掌握其操作方法。正确操作使用刻度吸管和可调微量取液器。熟练运用溶液混匀的各种方法(视具体情况,采用合适的混匀方法)。正确掌握溶液转移的操作。正确操作使用分光光度计。实验原理:(一)肝糖原的提取、鉴定糖原储存于细胞内,采用研磨匀浆等方法可使细胞破碎,低浓度的三氯醋酸能使蛋白质变性,破坏肝组织中的酶且沉淀蛋白质,而糖原仍稳定地保存于上清液中,从而使用糖原与蛋白质等其它成分分离开来。糖原不溶于乙醇而溶于热水,故先用95,乙醇将滤液中糖原沉淀,再溶于热水中。糖原水溶液呈乳样光泽,遇碘呈红棕色。这是糖原中葡萄糖长链形成的螺旋中,依靠分子间引力吸附碘分子后呈现的颜色。糖原还可被酸水解为葡萄糖,利用呈色反应和葡萄糖的还原性,可判定肝组织中糖原的存在。CuSO什2NaOH?Na2SO4+Cu(OH)2?2Cu(OH)2十C6H12O6?2CuO十氧化型葡萄糖+H2O2CuOH?Cu2O?红色)+H2OCu(OH)CuO?黑色)+H2O(二)肝糖原的定量糖原在浓酸中可水解成为葡萄糖,浓硫酸能使葡萄糖进一步脱水生成糠醛衍生物——5-羟甲基呋喃甲醛,此化合物再与蒽酮脱水缩合生成蓝色的化合物。该物质在620nm处有最大吸收。糖含量在(10?100)?g范围内,溶液颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。利用此反应与同样处理的已知葡萄糖含量标准溶液比色,通过标准对照法(直接比较法)即可计算出样品中糖原的含量。糖原在浓碱溶液中非常稳定,故在显色之前,肝组织先置于浓碱中加热,以破坏其它成分,而保留肝糖原。实验材料:(一)仪器普通离心机,室温?100?恒温水浴箱(X2),722型分光光度计,精度为10mg级电子天平(X1)剪刀(X1),镊子(X1),研钵(X1)试管架(X1),10mL离心管(X2),(100X15)mm试管(X6)刻度吸量管(2mLX1,5mLX2),1000^L微量可调取液器(X1)100mL容量瓶(X1)白瓷反应板(X1)(二)实验样品和试剂鸡肝。95,乙醇。(5,)三氯醋酸溶液:称取未潮解的三氯醋酸(C2HCl3O2,)5g,加蒸馏水溶解至100mL。:。12mol/LHCl:浓HCl原液(36%?38%。)(50,)NaOH:称取NaOH50g用蒸馏水溶解至100mL碘试剂:碘l00mg和K1200mg溶于50mL蒸馏水中。班氏试剂:称取柠檬酸钠(C5H5Na3O7?5H2,)173g和无水碳酸钠(Na2C03,)100g溶于蒸馏水800mL中,加热促溶。冷却,,硫酸铜(CuSO4?)l00mL,边加边摇。再加蒸馏水至1000mL混匀,如混浊可过滤取滤液。此试剂可长期保存。(30,)KOH溶液:称取KOH30g加蒸馏水溶解至100mL。标准葡萄糖液(50mg/L):称取已干燥恒重的无水葡萄糖25mg加蒸馏水溶解至500mL。17mol/L(90,)H2SO4:量取蒸馏水30mL加浓H2SO4500m。蒽酮显色剂:,用17mol/LH2SO4溶解至100mL。此试剂不稳定,以当日配制为宜,冰箱保存可用4?5天。实验方法:吸取1mL量溶液时使用可调微量取液器,吸取1mL以上量溶液时使用刻度吸量管。(一)肝糖原的提取与鉴定操作流程如下。鸡肝约1g,剪碎,l3COOH3ml研磨成肝匀浆3分钟(4000r/min),5ml95%乙醇,混匀,静置10分钟4000r/min)上清(弃去)沉淀,蒸镏水2ml鉴定方法?1ml,(2滴),(4滴)混匀沸水浴2注意事项肝糖原提取一步,向上清液中加入5mL95乙醇后,务必注意混匀。由于上清液为水溶液,比重大于95,乙醇,溶液分成两层。加之上清液已3mL多,总量接近9mL混匀操作比较困难,最好用倾倒混匀,也可用滴管或吸量管吸、吹混匀,或用玻璃棒搅拌混匀。糖原中葡萄糖螺旋链吸附碘产生的颜色与葡萄糖残基数的多少有关。葡萄糖残基在20个以下的会使碘呈现红色,20?30个之间使碘呈现紫色,60个以上的会使碘呈现蓝色。淀粉中分枝链较长,故呈蓝色,而肝糖原分枝中的葡萄糖残基在20个以下(通常8?12个葡萄糖残基),吸附碘后呈现红棕色。糖原水解液中葡萄糖的鉴定一步,加班氏试剂不能过量,否则反应液呈黑色浑浊,观察不到应有的