溶菌酶实验实验报告第七组样稿.docx

溶菌酶提取和系列性质测定
试验汇报
学院： 生物科学和工程学院
班级：
姓名：
学号：
组别： 第七组
组员：
一、试验内容：
溶菌酶提取和系列性质测定
在研究酶性质、作用、反应动力学等问题时全部需要使用高度纯化酶制剂以避免干扰。酶提纯工作往往要求多个方法交替应用，才能得到较为满意效果。常见提纯方法有盐析、有机溶剂沉淀、选择性变性、离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析等。酶蛋白在分离提纯过程中易变性失活，为能取得尽可能高产率和纯度，在提纯操作中要一直注意保持酶活性如在低温下操作等，这么才能收到很好分离提纯效果。
溶菌酶又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶、球蛋白G，是一个能水解致病菌中黏多糖碱性酶。关键经过破坏细胞壁中N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间β-1，4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，造成细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶还可和带负电荷病毒蛋白直接结合，和DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。×104，是一个强碱性蛋白质，，并对温度和酸不敏感。在自然界中，普遍存在于鸟类和家禽蛋清中，哺乳动物泪、唾液、血浆、尿液、淋巴液等细胞中，植物卷心菜、萝卜、木瓜等，以蛋清含量最丰富，%。
本试验用鸡蛋为原理，经过阳离子交换层析，硫酸铵沉淀，分子筛层析等步骤提取溶菌酶。
二、试验原理：
1蛋白质提取分离技术
以蛋白质和结构和功效为基础，从分子水平上认识生命现象，已经成为现代生物学发展关键方向，研究蛋白质，首先要得到高度纯化并含有生物活性目标物质。蛋白质制备工作包含物理、化学和生物等各方面知识，但基础原理不外乎两方面。一是得用混合物中多个组分分配率差异，把它们分配到可用机械方法分离两个或多个物相中，如盐析，有机溶剂提取，层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，经过物理力场作用使各组分分配于来同区域而达成分离目标，如电泳，超速离心，超滤等。在全部这些方法应用中必需注意保留生物大分子完整性，预防酸、硷、高温，猛烈机械作用而造成所提物质生物活性丧失。蛋白质制备通常分为以下四个阶段：选择材料和预处理，细胞破碎及细胞器分离，提取和纯化，浓细、干燥和保留。
微生物、植物和动物全部可做为制备蛋白质原材料，所选择材料关键依据试验目标来确定。对于微生物，应注意它生长久，在微生物对数生长久，酶和核酸含量较高，能够取得高产量，以微生物为材料时有两种情况：（1）得用微生物菌体分泌到培养基中代谢产物和胞外酶等；（2）利用菌体含有生化物质，如蛋白质、核酸和胞内酶等。植物材料必需经过去壳，脱脂并注意植物品种和生长发育情况不一样，其中所含生物大分子量改变很大，另外和季节性关系亲密。对动物组织，必需选择有效成份含量丰富脏器组织为原材料，优异行绞碎、脱脂等处理。另外，对预处理好材料，若不立即进行试验，应冷冻保留，对于易分解生物大分子应选择新鲜材料制备。

柱层析技术也称柱色谱技术。一根柱子里先填充不溶性基质形成固定相，将蛋白质混合样品加到柱子上后用尤其溶剂洗脱，溶剂组成流动相。在样品从柱子上洗脱下来过程中，依据蛋白质混合物中各组分在固定向和流动相中分配系数不一样经过数次反复分配，将不一样蛋白组分逐一分离。
　 依据填充基质和样品分配交换原理不一样，离子交换层析，凝胶过滤层析和亲和层析是三种分离蛋白质经典层析技术。
3 电泳技术
聚丙烯酰胺凝胶电泳是网状结构，含有分子筛效应，它含有两种形式，一个是非变性聚丙烯酰胺凝胶，蛋白质在电泳中保持完整状态，蛋白在其中依三种原因分开：蛋白大小，形状和电荷。
　　而SDS-PAGE仅依据蛋白分子量亚基不一样而分离蛋白。这个技术首先是1967年由shapiro建立，她们发觉在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基电泳迁移率关键取决于亚基分子量大小，电荷原因能够忽略。
　　SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子二、三级结构。而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使绊胱氨酸残基间二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束，所带负电荷大大超出了蛋白原有电荷量，这么就消除了不一样分子间电荷差异和结构差异。
　　SDS-PAGE通常采取是不连续缓冲系统，于连续缓冲系统相比，能够有较高分辨率。
　　浓缩胶作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀样品加在浓