壳聚糖球形多孔微载体制备及其肝细胞培养初步研究.pdf

上海交通大学
博士学位论文
壳聚糖球形多孔微载体制备及其肝细胞培养的初步研究
姓名:张瑞
申请学位级别:博士
专业:外科学(普通外科)
指导教师:彭承宏
20090501
壳聚糖球形多孔微载体制备及其肝细胞培养的初步研究摘要生物人工肝支持系统核心问题是高活性、高密度肝细胞的培养。近些年来,虽然有许多培养方式用于生物人工肝研究,如中空纤维管培养、胶原固定培养、球形聚集体培养和微囊包裹等培养方式,但这些方法都存在着一定程度的不足。微载体嘌蝗衔D壳笆歉呙芏扰嘌锵赴囊恢钟行Х椒ǎ苍谏工程中也得到了广泛应用,其多为实一心微载体。虽然目前研究和应用的大孔或多孔实心微载体具有许多优点,但是同样与理想中的生物人工肝所需研究的细胞高密度培养方法相差甚远。所谓理想中“真正的嗫微载体是具有与体内细胞三维环境生长相似的结构,即为内外都有孔,孔与孔之间有连接,内外孔相通,孔径相近,并且更需要那种适合细胞自由出入、能正常高活性的生长的孔,这样由于其比表面积大大的增加,将有利于黏附更多的细胞,多孔结构更有利于营养物质的传输和细胞的生长。目前有关多孔微载体的报道也极少,尚需进一步研究和开发。当前用来制备微载体的技术有:乳化交联法、凝聚/沉淀法、上海交通大学医学院博士学位论文中文摘要
喷雾干燥法、离子凝聚法、反相胶束法、乳液液滴凝聚法、滤筛法等。然而,这些技术制备的微载体大多是实心,其几何形状、大小和孔壁厚度都无法精确控制,所得微载体的分散性与稳定性不佳,其物理机械强度较差等缺点。最大的弊端在于,其制备的微载体比表面积较为局限,从而限制了其高密度、高活性地进行细胞培养。另外,目前用来制备微载体的材料也很多,其中壳聚糖是甲壳素的脱乙酰衍生物,是自然界唯一的碱性天然氨基多糖,其来源丰富、廉价,分子中含有带正电荷的氨基基团,且具有良好的生物亲和粘附性、相容性、功能性、低毒性、降解性、几乎无过敏性等。本课题采纳相关文献报道的研究经验和成果,在以往的研究工作基础上,进行了大量的理论考证和预实验,拟以壳聚糖为材料,采用液氮冷冻干燥技术制备球形多孔微载体,利用扫描电子显微镜燃术对其形态、物理和化学特性进行了表征。其次,对制备和表征成功的多孔微载体生物相容性进行评价,包括血液相容性萌苎!⒛!血小板计数、血小板聚集试验妥橹嗳菪利用细胞毒性、全身急性毒性、热原、皮肤刺激试验钠兰邸W詈螅狙芯拷ɡ弥票赋晒Φ目聚糖球形多孔微载体进行人肝细胞呐嘌⒍耘嘌南赴屑测和评价,包括形态学的观察赴剖⒌怪孟晕⒕倒鄄臁⑸璧缱酉微镜观察透蜗赴谷草转氨酶,谷丙转氨酶和乳酸脱氢酶水平其代谢活性椎鞍住⒛蛩亍⑵咸烟呛的测定。上海交通大学医学院博士学位论文中文搐要
养的人肝细胞哂懈呙芏取⒏咝院徒细叩墓δ堋⑨沸换钚浴结果显示如下:本研究成功地制备出壳聚糖球形多孔微载体,成球率ィ谕舛嗫浊蚁嗷チǎ拙对洌哂幸欢ǖ密度、弹性、溶胀性、亲和性和形态结构,并具有良好的机械强度、稳定性和较大的比表面积;此微载体溶血率结果小于ィJ匝椤⒀、热原和皮肤刺激试验结果均为阴性,表明此微载体符合生物医学材料的评价标准,其具有良好的生物相容性;利用此微载体成功地黏附培养了人肝细胞⑶矣胛尬⒃靥逑啾龋嘌母蜗赴有较好的形态,且肝细胞的数量、谷草转氨酶⒐缺0泵、乳酸脱氢酶椎鞍分泌的浓度、尿素合成量和葡萄糖牧烤贾彰飨愿哂诤笳,表明此微载体培所以,壳聚糖球形多孔微载体制备及其人肝细胞培养的初步研究成功,本研究成果为微载体在体外三维环境下肝细胞黏附培养提供了一定的理论基础和实验依据,也可望为肝细胞移植和生物人工肝提供足够数量、功能良好的肝细胞,具有较高的研究、应用前景和实用价值。关键词微载体,多孔,壳聚糖,细胞培养,生物人工肝上海交通大学医学院博士学位论文中文捕要
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