实验溶菌酶的粗提取、分离纯化及酶活力、纯度及分子量测定报告.ppt

实验1-3溶菌酶的提取分离及鉴定
(酶活力、纯度及分子量测定)
实验内容

、蛋白浓度测定

背景知识
溶菌酶( lysozyme):胞壁质酶( muramidase)或N-乙酰胞壁质
聚糖水解酶(N- acetylmuramide glycanohydrlase),是一种能水
解致病菌中黏多糖的碱性酶。
生物学效应:主要通过破坏细胞壁中的N乙酰胞壁酸和N-乙酰
氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键,使细胞壁不溶性黏多糖分解成可
溶性糖肽,导致细胞壁破裂内容物逸岀而使细菌溶解。该酶活
性可被一些金属离子Cu2+,Fe2+,Zn2+以及N-乙酰葡萄糖胺所抑
制,能被Mg2+,Ca2+、NaC所激活
N乙酸
Hthp
N乙酸图壁酸
溶菌酶作用位点

青霉素作用位点
G·对其敏感
Staphylococcus aureus
peptidoglycan
G·细胞壁肽聚糖组成
(缺壁0+:原生质体
溶菌酶理化性质:相对分孑质量14700Da,由
129个氨基酸残基构,pI:-,最适温度为
50℃,最适pH为6~7左右。280nm的消光系数
为

背景知识
酶的提取、分离纯化
初步纯化( rough fractionation)(提取):把酶从生
物组织或细胞中以溶解状态释放出来的过程,即将尽可
能多的酶,尽量少的杂质从原料中引入溶液。
高度纯化( fine fractionation)(精纯化):除去与产
物性质相似的杂质。
纯化方案评价:酶活力、蛋白浓度、绌度
粗纯化(提取)目标:
将目的酶最大限度地溶解出来
。
●注意:温度升高,溶解度加大。但为防止酶失活,
一般采用低温下(0~10°C)操作。
提取原则
。
,溶解度增加。
离心分离
)基本原理

F=ma。=mro2=mr(2元N60)2
N为离心机每分钟转数(r/min);
F通常以相对离心力RCF〔 relative centrifugal force)表
,即离心力F的大小相当于地球引力(重力常数g)的多少
倍。一般用g(或数字xg)表示
RCF=mr(2tN/60)2/mg=×105N2r
此公式描述了相对离心力与转速之间的关系
旋转半径用r平代替
r平均1/2(x大+小)cm
通常
低速离心以每分钟的转数表示,如
4000r/min。
高速离心(超速),常以相对离心力(RCF)表
示,如:65000g。
两者可换算或查测算图。
离心机的种类
名称
转速(r/min)
注意事项
低速离心机<6000
常温,注意样品热变性和离心
管平衡
高速离心机600025000冷冻(防止温度升高),
离心管的精确平衡
超速离心机
25000
冷冻+真空系统(减少空气阻
力和摩擦),
离心管的精确平衡