细胞冻存.doc

细胞冻存、解冻方法与细胞计数一、细胞冷冻保存 1. 材料: 生长良好之培养细胞、新鲜培养基、 DMSO(Sigma D-2650) 、无菌塑料冷冻保存管(Nalgene 5000-0020) 、 % ( w/v ) trypan blue(GibcoBRL15250-061) 、血球计数盘与盖玻片、等速降温机(KRYO10SeriesII) 2 、冷冻保存方法: ( 1) 传统方法: 冷存管置于 4℃ 10 分钟--->-20 ℃ 30 分钟--->-80 ℃ 16~ 18 小时( 或隔夜)---> 液氮槽 vaporphase 长期储存。-20 ℃不可超过 1 小时,以防止胞内冰晶过大,造成细胞大量死亡, 亦可跳过此步骤直接放入-80 ℃冰箱中,惟存活率稍微降低一些。( 2 )程序降温:利用已设定程序的等速降温机以-1~ -3℃/ 分钟之速度由室温降至( -80 ℃以下) -120 ℃,再放在液氮槽 vaporphase 长期储存。适用于悬浮型细胞与 hybridoma 之保存。 3 、步骤: ( 1 )冷冻前 24-48 小时更换半量或全量培养基,使细胞处于指数生长期。( 2) 配制冷冻保存溶液( 使用前配制): 另取一离心管, 加入培养基、血清, 逐滴加入二甲基亚砜( DMSO )至 20% 浓度, 即制成双倍的冻存液,置于室温下待用。( 3 )离心收集培养之细胞,用加血清的培养基重悬起细胞,取少量细胞悬浮液(约 ) 计数细胞浓度及冻前存活率。( 4 )取与细胞悬液等量的冻存液,缓慢逐滴加入细胞悬液,并晃动试管,制成细胞冻存悬液( DMSO 最后浓度为 5~ 10%) ,使细胞浓度为 1~ 5× 106cells/ml ,混合均匀,分装于已标示完全之冷冻保存管中, 1~ 2ml/vial ,并取少量细胞悬浮液作污染检测。严密封口后,注明细胞名称、代数、日期。然后进行冻存。 4 、注意事项: ( 1 )欲冷冻保存之细胞应在生长良好(logphase) 且存活率高之状态, 约为 80~ 90 %致密度。冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质,例如 hybridoma 应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。( 2 )细胞在液氮中可长期冻存无限时间,而不会影响细胞活力;在-70 度可保存数月。( 3) 注意冷冻保护剂之品质。 DMSO 应为试剂级等级, 无菌且无色(以 FGLP Telflon 过滤或是直接购买无菌产品,如 Sigma D-2650) ,以 5~ 10ml 小体积分装, 4℃避光保存,勿作多次解冻。 Glycerol 亦应为试剂级等级, 以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用, 因长期储存后对细胞会有毒性。本方法中先制备双倍冻存液,可避免 DMSO 直接加入时释放的热量对细胞的损伤。缓慢逐滴加入细胞悬液是使细胞逐步适应高渗, 可降低细胞受损。 DMSO 可能引起部分白血病细胞株的分化,可换用 10% 甘油冻存。( 4 )冷冻保存之细胞浓度: ① normal human fibroblast:1 ~ 3× 106cells/ml ② hybridoma:1 ~ 3× 106cells/ml ,细胞浓度不要太高,某些 hybridom a 会因冷冻浓度太高而在解冻 24 小时后死去。③ ad