目的基因的获得及方法.doc

目的基因的获得及方法.doc: .
»目的基因概念 沪获得目的基因方法
，构建cDN A文库
»构建基因组文库
»人工合成目的基因
»PCR合成
，其他方法：差异显示，基因陷阱
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目的基因的概念
基因是DNA分子上含特定遗传信息的核酸 序列的总称，是遗传物质的最小功能单 位。
目的基因：对基因组中某个基因通过克隆 扩增，获得该基因进行研究或应用称这种 基因为目的基因。
目的基因的用途
研究该基因的全貌与内涵：结构、功能、 调控
寻找异常基因异常点,
探索疾病的机理与
治疗 研究生物种系进化与相关同源性 基因工程重组表达
改造某些基因
基因治疗
A原核目的基因获得：直接分离
A真核目的基因获得：
》（一）载体：宿主细胞内可独立复制的完整DNA分子。
＞ 质粒（plasmid ）
＞噬菌体
＞ M13噬菌体
＞逆转录病毒DNA
＞昆虫病毒DNA （插入动物细胞）
A（二）目的基因的来源
＞从cDNA中分离
＞人工合成
＞反转录
基因文库
PCR
＞其他方法：差异显示，基因陷阱等
构建cDNA文库筛选目的基因
选林mRNA丰富，目的基因表达活跃
:防止RNA酶污染
构建流程
组织细胞
(破碎细胞，除去DNA与蛋白质 提取总RNA
ligo (dT)纤维素亲合柱层
合成cDNA第一链
I反转录
合成cDNA第二链
I插入载体
重组DNA
I导入大肠杆菌扩增
构建cDNA文库
RJE
restriction enzyme
AAA/KA 3"
» oligo(<iT)
AAAA/X
reverse trajoscriptase, + 4 dNTPs
GO<3
<30
CC
n, amplification
terminal traxisferase + dCFTP
ZaOH. remove mRZA DZA poll4-4dNTPS
图2—9 cDZA立库的枸建
terrnLirial transferase + dCTTP
GOO
ccc
iftRMA的分离
105gg/细胞，80-85%为rRNA, 45%小分 子量RNA （tRNA等）1-5%mRNA, 28S： 18S=2： 1
提取总RNA：常规方法；Trizon 提取纯化mRNA： oligo-dT柱
反转录合成
—台成cDN匕第一薙：氏转灵觀
”成山山第二链
》寻:;奢窝牯 “ B, if 丿
＞外加弓丨效/上了万匂法丿厶八$;卩/：詩
构建gIM文库
渗ciilA两端加接头或衔接头
>cDNA与载体相连
A导入宿主细胞进行克隆
筛选目的基因
核酸杂交法：探针
免疫结合法：抗体
其他方法：双杂交；基因芯片
构建基因组文库筛选目的基因
要求：全
流程：组织细胞
温和破碎细胞
UI
DNA片段与载体的连接包装
（限制性内切酶消化，噬菌体或粘粒 导入细胞
!核酸杂交 筛选目的基因
Vector DZA Eukaryote genomic DZA
in vitro packaging
Infect E・ cob
图2 — 8 基因组 DNA 文库的构建
人工合成目的基因片段
A原理：DNA是由孑，头磷酸二酯键连接
A技术：DNA自动合成仪
A方法
＞化学合成法：固相
＞酶促合成法：需模板
＞ PCR
其他方法
构建差示文库（扣除文库）筛选
特殊基因
＞兰自厂阵丄
反映不同组织细胞或同一种细
胞在不同功能状态下，基因表达差异的 gDNA文库。用于研究细胞的发育、分化、
细胞的分裂周期、细胞对药物和生长因子 的诱导反应以及肿瘤等疾病的分子基础。
方法：构建两个cDNA文库f杂交f轻基磷
灰石柱分离f构建cDNA文库
mRNA差示显示法获得目的基因
A原理：一般45%基因表达，而且在不同状 态表达的基因是不同的
方法：PCR扩