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交联柚苷酶聚集体的制备及其应用
交联酶聚集体 (cross-linked enzyme aggregates, CLEAs) 是一类新型的无
载体酶固定化技术 , 具有制备成本低廉、操作简单、酶活回收率高、稳定性好、
可重复使用等优点 , 在生物酶催化领域具有重要的研究意义。 柚苷酶是由 a-L- 鼠
李糖苷酶 () 和 p-D- 葡萄糖苷酶 () 组成的复合酶 , 在α-L-
鼠李糖苷酶的作用下能够将柚皮苷水解为普鲁宁 (4,5,7- 三羟基黄烷酮 -7- 葡萄
糖苷 ) 和 L- 鼠李糖 , 然后在 p-D- 葡萄糖苷酶的作用下继续将普鲁宁水解为柚皮素
(4,5,7- 三羟基二氢黄酮 ) 和葡萄糖。
普鲁宁具有杀菌、抗氧化、抗病毒、抗缺血、抗肿瘤、抗过敏、消炎等多种
药理活性 , 同时对治疗心血管疾病和慢性疾病有着重要的作用。将 CLEAs用于柚
苷酶的固定化 , 能够提高酶的温度稳定性、酸碱稳定性 , 对提高普鲁宁的产量 , 降
低生产成本 , 提高酶的催化效率、实现酶的重复使用具有重要的研究价值。
目前 , 尚未有采用交联柚苷酶聚集体制备普鲁宁的相关报道。本文采用
CLEAs固定化柚苷酶 , 并对其制备工艺进行优化。
利用交联柚苷酶聚集体的酶学性质 , 以柚皮苷为底物 , 分别在水相和有机相
／水相双相体系中制备普鲁宁。以制备得到的普鲁宁为原料 , 采用聚酰胺树脂对
普鲁宁进行分离纯化 , 为普鲁宁的制备和分离纯化提供了参考依据。
主要研究内容如下： (1) 对交联柚苷酶聚集体的制备工艺进行优化 , 并对其酶
学性质进行研究。研究结果表明：以 倍发酵液体积的叔丁醇为沉淀剂 ,%
的戊二醛为交联剂 , 在 ℃条件下交联 , 得到的交联柚苷酶聚集体的酶活
回收率为 %。
通过对交联柚苷酶聚集体的性质进行研究 , 结果表明 , 交联柚苷酶聚集体的
最适反应温度为 50℃, 最适 pH值为 , 最大反应速率为 Vmax为 μ
mol·mL-1·min-1,Km 为 。与游离酶相比 , 交联柚苷酶聚集体具有良
好的温度稳定性和酸碱稳定性。
4-C 条件下存放 33 天, 其酶活保留率为 %, 说明交联酶聚集体具有良好
的存储稳定性。 (2) 利用交联柚苷酶聚集体水解柚皮苷制备普鲁宁 , 并采用正交设
计对其制备工艺进行优化 , 其最优的制备工艺条件为：底物浓度 pH值 、温度
65℃、加酶量 、反应时间 , 优化后制备得到的普鲁宁浓度为
、得率达到 %。
交联酶聚集体连续使用 3 个批次后 , 普鲁宁得率为 %, 说明交联酶聚集
体的稳定性较好。 (3) 以交联柚苷酶聚集