免疫实验设计高山.doc

免疫实验设计高山.doc染色质免疫共沉淀(X-ChIP)实验设计
设计人：高山牡丹江医学院硕士研究生
Chip是一种强大的确定蛋白或者组蛋白修饰在基因组上定位的实验方法。染色质被分离出 来后采用抗体与抗原的结合来判定目的蛋白是否结合在特定的DNA序列上或者判定目的蛋 白结合位点在全基因组范围的分布(微阵列或DNA序列)。这种方法具有空间性与时效性。 该实验设计为如何在细胞中进行ChIP实验提供了详细的步骤。
1交联和细胞收获。
甲醛可以将蛋白质交联到DNA上。交联结果的好坏决定于交联时间的把握。我们建议样品 交联的时间一般为2-30分钟。过度的交联会减少抗原的结合性和超声断裂的效率。抗原决 定簇也会被掩盖。加入甘氨酸可以消除甲醛使交联反应终止。
(1 *107-5*107个细胞/皿)o将甲醛直接滴入PBS 洗过的细胞培养皿中，%,然后在室温缓慢旋转10分钟，使蛋白和DNA 发生交联。
2加入甘氨酸使其终浓度为125mM,在室温晃动孵育5分钟。
3使用10ml预冷PBS清洗细胞2次
4使用细胞刮将细胞收获放入5ml预冷PBS中，并转入50ml的管子。
,将剩余的细胞转移到50ml管子里
6 1, 000g离心5分钟
，使用FA裂解液将沉淀重悬浮(lxl07cells/750m).
初始细胞要有1*107-5*107个，%甲醛和如上描述的甘氨酸处理。预冷PBS 洗3次，1, 000g离心5分钟，沉淀用FA裂解液重悬浮。
2o超声破碎 超声裂解细胞悬液可以将DNA均一的打断成500-1000bp
的片段。不同的细胞系需要不同的 超声时间才能达到最优效果。
交联细胞要通过时间梯度的超声来选择最优超声条件。样品通过时间梯度，DNA的分离如
部分3所描述。%的琼脂糖凝胶上检测分析。如图一所示
U20S
M 5* 10' 15'20' Sonication
W
2036——
■
1018
500-W ...
技||h
图一：
2超声破碎后，8, 000g, 30秒，4。（2,离心。将上清移入新的管子中。开始准备进行染色质 免疫共沉淀（IP）。
3每份超声样品取50ul,这时的样品标记为INPUT,用于定量DNA浓度和作为PCR的空 白对照。
超声后的染色质应立刻冻入液氮中或者储存于-70 °C可储存2个月。避免多次反复冻融。
3检测DNA浓度
INPUT样品用于为后来的IP样品计算DNA浓度。DNA可采用PCR纯化试剂盒（加入
70ul洗脱液，）或者采用酚/氯仿抽提（加入350ul洗脱液，
行）
RNaseA( mg/ml).加热至65 °C摇晃4-5小时或者过夜以逆转交联。DNA采用
PCR纯化试剂盒中厂家说明进行纯化。样品冻存于-20 °C.
样品之所以加入RnaseA是因为高浓度RNA会在使用PCR纯化试剂盒时干扰DNA的纯化。 而纯化柱子的饱和度是既定的。
(20 mg/ml),加热至65 °C摇晃4-5小时或者过夜以逆转交联。采用酚/ 氯仿抽提的DNA使用乙醇沉淀于10ul的糖