蛋白酶活性的测定方法.ppt

蛋白酶活性的测定方法及原理
罗老师
组员
宁舒婷
陈丽君
陈海梅
王熙栋
各种测定方法及原理
考马斯亮蓝法
甲醛滴定法
DHT-酪蛋白法
DNA-溴乙锭荧光分析法
X-光胶片法
福林酚法
甲醛滴定法
物呈上述反应，利用此原理测定蛋白酶酶活。
考马斯亮蓝法
福林酚法
重点
本次实验就是采用福林酚法测定蛋白酶活性
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精选ppt
福林酚法测定蛋白酶活性
蛋白酶对酪蛋白、乳清蛋白、谷物蛋白等都有很好的水解作用。磷钨酸和磷钼酸混合试剂，即福林-酚试剂，碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原而呈蓝色反应（钨兰和钨兰混合物）。由于蛋白质中含有具有酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），因此，蛋白质及其水解产物也呈此反应。利用蛋白酶分解酪素（底物）生成含酚基氨基酸的呈色反应，来间接测定蛋白酶的活力。
原理
分析天平：
恒温水浴：精度±℃
计时表
分光光度计
沸水浴器
振荡混合器
pH计:
乳酸缓冲液（pH=）适用于酸性蛋白酶
磷酸缓冲液（pH=）适用于中性蛋白酶
硼酸缓冲液 (pH=) 适用于碱性蛋白酶




100μg/ml酪氨酸标准溶液
试剂
仪器
标准曲线的绘制
试管0
试管1
试管2
试管3
试管4
试管5
100μg/ml酪氨溶液（ ml ）
O
1
2
3
4
5
蒸馏水（ ml ）
10
9
8
7
6
5
酪氨酸实际浓度 （μg/ml ）
O
10
20
30
40
50
L-酪氨酸标准溶液按下表配制
(须做平行试验)，。,置于40+℃水浴中显色20min,取出用分光光度计于波长680nm,比色，以不含酪氨酸的0管为空白管调零点，分别测定其吸光度值，以吸光度值为纵坐标，酪氨酸的浓度为横坐标，绘制标准曲线或计算回归方程。计算出当OD为1时的酪氨酸的量（μg），即为吸光常数K值，其K值应在95~100范围内。
实验步骤
②
③
①
先将酪素溶液放入40±℃恒温水浴中，预热5min
取4支试管，各加入1ml酶液
取一支作为空白管，加2ml三氯乙酸，其他3管作为测试管各加入1ml酪素，摇匀，40℃保温10min
⑤
⑥
④
取出试管，3支测试管中各加入2ml三氯乙酸，空白管中加1ml酪素。
静置10min，过滤沉淀
各取1ml滤液，、福林试剂1ml。在40℃显色20min 680nm处测OD值。以空白管调零点。
蛋白酶活性的计算
K：吸光常数
Title
1g固体酶粉（或1ml液体酶），在40℃（酸性pH=、中性pH=、碱性pH=）条件下，1min水解酪素产生1μg酪氨酸为一个酶活力单位。
定义
计算
蛋白酶的活力= A×K×4/10×n U/g(ml)
A：样品平行试验的平均OD值
K：吸光常数
4：反应试剂的总体积
0：酶解反应时间
n：酶液稀释总倍数
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思考题
Title
蛋白酶有哪几类？
①按蛋白酶水解蛋白质的方式：A内肽酶：切开蛋白质分子内部肽键，生成相对分子质量较小的多肽类；B外肽酶：切开蛋白质或多肽分子氨基或羧基末端的肽键，而游离出氨基酸的酶类；C水解蛋白质或多肽的酯键；D水解蛋白质或多肽的酰胺键。
②按酶的来源可分为：动物蛋白酶、植物蛋白酶、微生物蛋白酶
③微生物蛋白酶又可分为：细菌蛋白酶、霉菌蛋白酶、酵母蛋白酶和放线菌蛋白酶
④按蛋白酶作用的最适PH可以分为（A）~，（B）~，（C）PH7~8的中性蛋白酶
影响酶活力的因素有哪些？
①酶浓度对酶活力的影响：酶促反应速率与酶分子的浓度呈正比，在一定范围内，当底物分子浓度足够时，酶分子越多，底物转化的速度越快。
②底物浓度对酶活力的影响：若酶的浓度为定值，底物的起始浓度越低时，酶促反应速度与底物浓度呈正比，即随底物浓度的增加而增加。当
所有的酶与底物结合生成中间产物后，即使再增加底物浓度，中间