蛋白酶活性测定方法.doc

水产动物酶活性测定方法一、分析样品的采取与处理每箱随机各取3尾异育银鲫,称重,于冰盘上解剖,取出肠道和肝胰脏,测定肠道长度,剔除脂肪组织,用4℃冷却的去离子水冲洗;然后用滤纸轻轻吸去水分,放入—26℃冰箱中迅速冷却保存,供测酶活性用。二、酶液的制备将肝胰脏及肠组织缓慢解冻后,肠道匀分三等份,从前、中、,放入离心塑料管中,加4ml,4℃冷却去离子水稀释,4℃下离心20min(13,000g),上清液标号分装,并与4℃冰箱中冷却保存,24Hr待测。将肝胰脏及肠道组织用4℃去离子水清除肠道内容物后,用滤纸吸去表面水,。按样品重量加10倍的4℃冷却去离子水在冰浴下匀浆(稀释匀浆液匀浆4min,800rpm匀浆玻璃管外设冰浴)。匀浆液在4℃下离心20分钟(13,000g),上清液标号分装,并于4℃冰箱冷却保存,24Hr内测定完毕。酶粉及饲料:,,并放在40℃水浴中恒温30分钟,过滤留置滤液待测。测定前再稀释10倍,20倍,100倍即可。,,并放在40℃水浴中恒温30分钟,过滤留置滤液待测。三、酶活性测定蛋白酶测定:前、中、后肠,肝胰脏。方法:福林—:蛋白酶从变性的酪蛋白中分解出可溶于三氯乙酸(TCA)的氨基酸(如酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等),这些氨基酸可用福林试剂使之发色(蓝色反应),用分光光度计测定。:1克食靡或组织在30℃,,每分钟水解酪蛋白产生1微克酪氨酸的酶量为1个酶活力单位。(已配):取无水碳酸钠(Na2CO3),000ml,存放与具胶塞的试剂瓶中。(TCA):,加水溶解后定容为1,000ml。L—酪氨酸。缓冲液:磷酸二氢钙—氢氧化钠缓冲液。A:(ml):50;B:(ml):水(ml)(20℃)::,,加入少量缓冲液,在沸水浴中加热,经常但不要剧烈的搅拌使之完全溶解,冷却后移入100ml容量瓶中,并用相应的缓冲液定容到刻度。若定容时泡沫过多,可加入1~2滴乙醇消泡。酪蛋白溶液可在4℃保存一周,变质后不能使用。—酪氨酸(先在105℃干燥2~3Hr)。酪氨酸必须完全干燥并且是色谱级别,一定要酪氨酸完全溶解,并且用去离子水稀释至1L,该溶液含酪氨酸100微克/毫升。根据下面的规定,从上述储备溶液制备含酪氨酸10、20、30、40、50、70、80微克/毫升。移取上述溶液2ml,加入一系列试管中,,立即混合均匀,并在30℃恒温水浴中显色20min,以721型(或72型)分光光度计在波长680nm处测定光密度(O。D值)。计算K值;以OD值为纵坐标,酪氨酸溶度为横坐标,绘制标准曲线,`微克数,确定K值。℃恒温水浴中预热