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蛋白酶活性测定方法
蛋白酶活性测定方法
蛋白酶活性测定方法
蛋白酶活性的测定方法(GB／T2352７—2０0９)
1 原理
蛋白酶对酪蛋白、乳清蛋白、谷物蛋白等都有很好的水解作用。磷钨酸和磷钼酸混合试剂，即福林-酚试剂，碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原而呈蓝色反应（钨兰和钨兰混合物)。由于蛋白质中含有具有酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），因此，蛋白质及其水解产物也呈此反应。利用蛋白酶分解酪素（底物）生成含酚基氨基酸的呈色反应，来间接测定蛋白酶的活力.
2 仪器和设备
2。1　分析天平:精度0。0001g
２．2 恒温水浴:精度±0。２℃
2。3　计时表
2。４ 分光光度计
　沸水浴器
　振荡混合器
2。７ pH计:　精度0。０1ｐH单位
3 试剂和溶液　
乳酸缓冲液（ｐH＝３．0）适用于酸性蛋白酶　
甲液：称取乳酸(８0%-90％）1０．6ｇ，加水溶解并定容至1000ml。
乙液:称取乳酸钠（70%)16g,加水溶解并定容至1000ml。
使用溶液:取甲液8ｍｌ，加乙液１ml,摇匀,稀释一倍,。
３。2　磷酸缓冲液的制备（pH＝)适用于中性蛋白酶
准确称取磷酸氢二钠（）（NａH2PＯ３．2H2O）０．5g，加水定容至1０00ml　
3。3 硼酸缓冲液(pH=10．５) 适用于碱性蛋白酶
蛋白酶活性测定方法
蛋白酶活性测定方法
蛋白酶活性测定方法
甲液：,加水溶解并定容至1000ml。
乙液： 称取氢氧化钠4。０ｇ,加水溶解并定容至1０00ml。
使用溶液：取甲液５00ml，加乙液400ｍl，摇匀,用水稀释至1L.　ﻫ3。4　:
,以蒸馏水溶解定溶至100０ｍl.
3。５ 0．4ｍol/L的三氯醋酸液:　
准确称取65。4三氯醋酸，以蒸馏水溶解定溶至1000ml
3。6 0。5mol/L的NａＯH:
准确称取2g ＮaOH溶解并定至100mｌ
10．00mg/ml酪素溶液
称取酪素1。０0０g,准确至0。0０1g，（若为酸性蛋白酶则用浓乳酸2－３滴)润湿,，加入适量的各适宜的缓冲液约８0ｍl，在沸水浴中边加热边搅拌,直至完全溶解，冷却后,转入10０ｍｌ容量瓶中，用适宜的缓冲液稀释至刻度，此溶液在冰箱内贮存,有效期为三天.
　10０μg/ml酪氨酸标准溶液　
准确称取预先于105℃干燥至恒重的Ｌ－酪氨酸0。１000g　，用1mol/Ｌ的盐酸60ml 溶解后定容至10０ml，即为1．0０mｇ/ｍl的酪氨酸溶液.　
。2 吸取1．00mｇ/，用０。1moｌ/Ｌ盐酸定容至100mｌ,即得10０。0μg/ｍl　Ｌ—酪氨酸标准溶液.
酶样的制备
准确称取1。000g固体酶或移取1mｌ液体酶样，用少量的适宜缓冲液溶解并用玻璃棒捣研,然后将上清液倒入100ml容量瓶，沉渣中再添入少量缓冲液捣研多次，最后全部移入容量瓶，稀释到刻度，用四层纱布过滤。