琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制.ppt

琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制
实验操作：
(1)肝糜液的制备
用颈椎脱臼法处死小白鼠
将肝脏取出置于研钵，用生理盐水洗净，剪碎肝脏充分研磨至糊状
分批加入磷酸缓冲液，边加边磨，总共7ml
搅琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制
实验操作：
(1)肝糜液的制备
用颈椎脱臼法处死小白鼠
将肝脏取出置于研钵，用生理盐水洗净，剪碎肝脏充分研磨至糊状
分批加入磷酸缓冲液，边加边磨，总共7ml
搅匀后倒入圆底离心管，离心3分钟
将上清液倒入一支试管中备用，即为含有琥珀酸脱氢酶的肝糜液
实验操作：另取中试管5支，标号 琥珀酸脱氢酶活力的测定
编号
1
2
3
4
5
%琥珀酸钠溶液/ml

——



%草酸钠溶液/ml
——




蒸馏水/ml



——
——
肝糜液/ml





甲烯蓝/ml





摇匀，静置于37摄氏度的水浴中（此后再勿摇动）注意观察各管的颜色变化，记录各管颜色消退的顺序和时间，分析原因，振荡褪色的反应液，观察实验现象并分析产生该现象的原因。
1>肝脏一定要充分研磨至糊状，一使琥珀酸脱氢酶尽量释放到溶液里
2>离心时注意离心管一定要精确平衡，并将重要相等的离心管对称放置
3>离心结束后拿取离心管时动作要轻柔，不要振荡离心管，以免肝糜液重新变浑浊
注意事项：
思考题：
1:为什么反应开始后，反应液必须静止，不能在摇动?
避免空气中的氧接触反应溶液，使的还原性的甲烯白重新氧化成甲烯蓝
思考题：
2:本实验为何选择肝脏来提取琥珀酸脱氢酶？本实验成功的关键是什么？
思考题：
3：抑制剂还可以选用什么物质？
还可以选用丙二酸
4：利用本实验的数据，说明酶竞争性抑制的特点？
竞争性抑制剂往往是酶的底物类似物或反应产物；；，则抑制作用越大；但增加底物浓度可使抑制程度减小；：Km值增大，Vm值不变。
思考题：
5：本试验在设计上存在某些缺陷，指出存在的缺陷与改进方案？
补充：
琥珀酸脱氢酶（Succinatedehydrogenase，简称SDH），黄素酶类，是线粒体内膜的结合酶，属膜结合酶，是连接氧化磷酸化与电子传递的枢纽之一，可为真核细胞线粒体和多种原核细胞需氧和产能的呼吸链提供电子，为线粒体的一种标志酶。
　　琥珀酸脱氢酶有两种，一种是以泛醌作为受体的，另一种是作用于所有受体。
琥珀酸脱氢酶活力测定方法目前主要有五种
（PMS）反应法
[K3Fe（CN）6]还原法
（氯化三苯四氮唑）法

（氯化硝基四氮唑蓝）法
（PMS）反应法
琥珀酸脱氢酶能通过一系列人工电子受体，如与PMS（吩嗪二甲酯硫酸盐），DCPIP（2，6-二氯酚靛酚）等发生反应催化琥珀酸的氧化，而借助这些中间产物的颜色变化，通过分光光度计检测即可加以定量反映，其反应式为：①Succinate＋PMS→Fumarate＋PMSH2；②PMSH2＋DCPIP→PMS＋DCPIPH2。DCPIP呈蓝色，标准的吸收光谱在600nm处，这种色泽可因其还原而渐次变淡，从而600nm处的光密度的变化与DCPIP含量成正比，-DPIP的还原速度可以推算出SDH的活力。一分子DCPIP被还原，即代表一分子琥珀酸被氧化。故可测定此反应系统在600nm处的吸收光度变化，来计算SDH的活性。SDH活性计算：（标准－测定）/标准=μmol/min/mg。
[K3Fe（CN）6]还原法
　　以铁氰化钾[K3Fe（CN）6]和琥珀酸钠为底物，使琥珀酸脱氢酶催化反应将铁氰化钾还原为亚铁氰化钾[K4Fe（CN）6]，K4Fe（CN）6再与Fe3＋作用生成普鲁士蓝，在700nm波长测定吸光值，以检测普鲁士蓝之生成量，作为琥珀酸脱氢酶的还原力，吸光值愈高表示琥珀酸脱氢酶活力愈强。
（氯化三苯四氮唑）法
　　无色TTC（2，3，5-氯化三苯基四唑）作为人造受氢体，它在细胞呼吸过程中接受氢，还原成三苯基甲膳（TF）。后者以红色晶体的形式存在于细胞内，采用有机溶剂（如甲苯、乙酸乙醋、三氯甲烷、丙酮或乙醇等）进行萃取。萃取液测定485nm吸光度后，以TTC还原量表示脱氢酶活性，